PKCalpha和PKCepsilon对人内皮细胞NOX4基因表达调节的不同作用.docVIP

PKC alpha 和PKC epsilon 对人内皮细胞NOX4 基因表达调节的不同作用 华中科技大学同济医学院同济医院麻醉学教研室（430030） 徐卉 陈映红 李会革 田玉科 目的：体外循环中白细胞激活和缺血后再灌注可诱发全身炎症反应综合征（SIRS），出现急性血管损伤。氧自由基（ROS）的生成和激活参与其发生机制。NADPH氧化酶是血管壁中过氧化物产生的主要来源。体内激活PKC可诱导NADPH氧化酶活性增加。本研究拟探讨PKC 对人血管内皮细胞NADPH氧化酶基因表达的调节作用。 方法：分别用PKC激活剂佛波醇酯CM-H2DCFDA测定细胞内ROS合成。用lucigenin 化学发光法测定细胞内外ROS生成量。用siRNA技术敲除细胞内PKC alpha 和epsilon 基因后，再检测NOX4mRNA 在各处理中的表达及氧自由基的生成。用PKC生理激活剂VEGF处理HUVEC细胞，观察细胞增殖及运用Matrix-gel 检测血管新生实验。应用SPSS 8.0 统计学软件进行分析，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。 结果：用PMA处理HUVEC或EA.hy926 内皮细胞，可双相调节NOX4基因表达，这种调节依赖PKC的膜转运激活。PMA处理后6小时，NOX4基因水平下调（p0.01）；处理48小时后，NOX4 基因水平上调（p0.01）。与此相应，6小时细胞生成的ROS减少（p0.01），48小时细胞生成的ROS明显增加（p0.01）。PKC抑制剂G?6983可抑制PMA对NOX4基因表达的调控和对ROS产量的影响（p0.01）。人内皮细胞NOX4 mRNA半衰期约为6小时，PMA处理不影响NOX4 mRNA 的稳定性。 在人EA.hy926细胞，PMA 可激活PKC 亚型 alpha 和 epsilon。用siRNA 技术敲除内皮细胞的PKC epsilon 亚型后， PMA 6小时处理不再使NOX4 mRNA 基因表达下调（p0.01）；敲除PKC alpha 亚型后， PMA48小时处理也不再上调 NOX4 mRNA 基因表达，与此相应，ROS生成量明显低于对照组（p0.01）。VEGF可激活HUVEC PKC alpha亚型，上调NOX4 mRNA 表达（p0.01），并促进细胞增殖和血管新生。 结论：PKC化学激活剂PMA或生理激活剂VEGF 均可激活内皮细胞PKC alpha，上调NOX4 mRNA表达，增加ROS生成，并促发内皮细胞增殖和血管新生，是体外循环中引起血管急性损伤的发生机制之一。因此选择性抑制或敲除PKC alpha 可视为一种预防或治疗脉管系统氧化应激损伤的新策略。 09年会-麻醉学基础研究