一种新的产生天然蛋白的不依赖于连接的克隆载体.pdfVIP

第 31卷第 4期 湖北大学学报(自然科学版) Vo1．31 No．4 2009年 12月 JournalofHubeiUniversity(NaturalScience) Dec．，2009 文章编号：1000—2375(2009)04—0415—04 一 种新的产生天然蛋 白的不依赖于 连接的克隆载体 谈蓉 ，马立新 (1．南通大学 生命科学学院，江苏 南通 226007；2．湖北大学 生命科学学院，湖北 武汉 430062) 摘要：报道一种新的不依赖于连接的克隆(LIC)载体．该载体被缺刻的内切酶N．Bb~IA和限制性内切酶 棚I作用产生长的粘性末端．靶向基因的PCR片段在 4mmol／LdGTP的孵育下被T4DNA聚合酶处理生成互 补粘性末端．将处理过的载体和PCR产物共转化到大肠杆菌体内，插入载体的接合能够被宿主酶和给定的重组 质粒修复．接着引入到大肠杆菌表达系统 ，该融合蛋白能够被表达和纯化，再用烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶处理 将移去靶蛋白的N末端，产生天然蛋 白．两个基因，绿色荧光蛋 白基因egfp和硫氧环蛋 白基因 ￡捌 已被用于这 个系统．结果表明LIC策略对于高通量克隆和表达是高效的，对于天然蛋白的产生也同样高效． 关键词：不依赖连接的克隆；烟草蚀刻病毒 (TEV)蛋 白酶 ；天然蛋 白 中图分类号 ：Q782 文献标志码 ：A DOI：10．3969／j．issrL1000—2375．2009．04．022 高通量表达和纯化蛋 白质的方法在蛋 白组时代是必需的[1]．目前，已经发展了各种克隆策略的表达 系统来迎接该挑战L2j．其 中，不依赖于连接的克隆(LIC)方法是独特的．在 T4DNA聚合酶的3’一5’外 切酶活性下和一种 dNTP的孵育下，插入片段能产生 10到 15个碱基的粘性末端[3]．载体和 PCR片段 依靠长的粘性末端重组，而不需要连接酶．这种克隆方法不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被 克隆到该载体中．而且，整个流程简单到不需要任何限制酶和连接酶_4]．几种不同标签的LIC表达载体 已经被用于基因组表达计划l5]．同时，一些 LIC表达载体也被用于大肠杆菌体 内蛋 白质的高效共表 达L6]．但是，现有的IIC在载体处理方面有一定不足，外切酶或者多聚酶可能不能用来形成有效的长的 粘性末端，而且一些错误的分子很难用常规的方法来分离，导致 了高背景．文中介绍的这种新的载体处 理方法，带有正确粘性末端的线性化载体能够通过琼脂糖凝胶系统简单地从其他的载体中分离出来，大 大地降低了载体 自连背景．亲和融合标签，比如Hise—tag，GST等，被广泛地用来纯化表达蛋 白_l7]．由于 这些标签可能干扰 目标蛋 白的生物学活性或者晶体结构，通常会将这些标签用蛋白酶切除．为了移去这 些标签，一个传统的方法是在标签和感兴趣的蛋白中加上一个 内蛋 白酶的切割位点用于后面的亲和纯 化．TEV蛋 白酶是很合适的一种 ，因为该酶具有很高的特异性 ，在低温和高离子强度下保持了高的酶活 性[8]．然而，传统的IIC载体处理后，在 目标蛋白上仍然存在几个氨基酸．本文 中提到的LIC载体上的 粘性末端属于TEV识别位点，位点能够完全被移去，天然的 目标蛋白得到了．对于蛋 白质组的研究，这 个新策略让融合蛋 白的表达更加简单方便． 1 材料与方法 1．1 菌株和质粒 大肠杆菌菌株 XL10一Gold和 BL21(DE3)购 自Strategene公司．质粒 pET30a购 自 Novagen公司．质粒 pGEX4T一1购 自AmershamBioscience公司．质粒 pFastBacTM1购 自Invitrogen公 司．质粒 pEGFP一1购 自Clontech公司． 收稿 日期 ：2009—07—07 基金项目：863计划(2004BA711A19)资助 作者简介：谈蓉(1982一 )，女，硕士，助教；马立新，通讯作者，Email：malixing@hubu．edu．cn 湖北大学学报 (自然科学版) 第 31卷 1．2 酶 限制性 内