四环素及其衍生物诱导表达的pTet-On肺癌细胞系A549的建立.pdfVIP

JournalofMathematicalMedicine Vo1．22 No．2 2009 文章编号：1004一-4337(2009)02-一0158--03 中图分类号：R737．33 文献标识码：A ·临床科研分析 · 四环素及其衍生物诱导表达的pTet—On肺癌 细胞系A549的建立△ 曹晓敏 林仲秋 庞战军一 全 松一 邢福祺一 (中山大学附属第二医院妇产科 广州 510120) 摘 要： 目的：构建可受四环素诱导调控的高表达外源基因的真核表达体统A549pTevOn细胞系。用于F10基因的功能研 究。方法：将 pTet-On质粒用脂质体介导法转染 A549细胞，利用 G418的药物选择特性，对转染的A549细胞进行压力筛选后的克 隆用有限稀释法进行单克隆化，单克隆分别扩增后，瞬时转染 pTREquc(编码荧光素酶蛋 白)质粒，Dox诱导表达后，检测荧光素酶 活性，逐一筛选四环素调控高表达外源基因的A549pTet-On细胞株 。结果：成功构建了一株受 Dox调控 的高表达低背景的A549 pTet--On细胞株。结论：筛选的A549细胞为F10基因表达能被pTet—on诱导表达系统调控的细胞系，为研究F10基因功能提供了理 想的细胞模型。适合在此基础上对F10基因进行深入的研究。 关键词： 四环素； F10基因；基因调控 F10基因是新克隆的在葡萄胎中表达上调的功能未知的 1 材料与方法 新基因[】]，在大多数基因治疗或研究基因功能时，多数转基因 都是持续表达的，没有表达量和表达时间的调控。很多情况 1．1 质粒 下，这种持续表达外源基因不论是基因功能研究还是基因治 pTet-On、pTRE-Luc、IX)X、Lipofectamin2000、无 四环素 疗都存在很大局限。pTet-On基因表达系统是 1992年Gos-一 污染的胎牛血清购 自Clongtech公司。G418、DMEM购 自Gi— sen[。]等设计的一种受 四环素调控外源基因表达的高效真核 col公司，LueiferaseAssaySystem为Promega公司的产品。 1．2 细胞系及培养条件 表达体系，该系统有两种表达质粒即调节质粒和反应质粒组 肺癌细胞系A549(广州医学院医学实验中心保存、复苏) 成，调节质粒可表达一种融合蛋 白称四环素反应转录活化因 培养于含 1O 胎牛血清的RPMI-1640的培养基中，在 37℃、 子 (Tet_resp0nsivetranscriptiona1activator，tTA)，该因子可与 5 C0z条件下培养。 反应转录的四环素反应性元件 (Tet-responsiveelement，TRE) 1．3 建立表达 pTet-On的稳定克隆 结合。在没有四环素(tetracycline)或其衍生物强力霉素存在 Lipofectamin-2000介导的稳定转染：转染前 24h细胞种 的情况下，引起插入启动子下游 目的基因的高效表达。随着 于6孔板 (2mL含 15 小牛血清的RPMI-1640／~L)，待细胞生 四环素浓度的增加，基因的表达 以一种剂量依赖性的方式逐 长至9O ～95 的融合度时开始转染。转染时备两个 Ep,一 渐关闭直至为零。1995年Gossen等通过改变 tTA的氨基酸