丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响.x.docxVIP

丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响中华皮肤科杂志 1999年第1期第32卷 短篇论著作者：李明　王强　杨春欣　陈蕾　秦万章单位：李明　王强　陈蕾　秦万章(200032 上海医科大学中山医院皮肤科)；杨春欣(中草药制剂室)丹参治疗系统性硬皮病(SSc)有较好的疗效。我们曾观察到丹参可抑制SSc患者皮肤成纤维细胞增殖，降低细胞培养基中可溶性胶原的含量，但引起胶原合成减低的作用机制尚不清楚。我们以SSc患者皮肤成纤维细胞为研究对象，通过观测丹参加入细胞培养基后对该细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA含量的影响，从胶原基因表达方面对丹参治疗SSc的药理机制进行探讨。一、材料与方法(一)丹参制剂：丹参注射液是上海第一制药厂产品(批号95038，每mL折合丹参生药1.5g)；丹参素购自上海医科大学天然药化教研室；原儿茶醛(3，4-二羟基苯甲醛)系上海试剂一厂产品(批号86-07-01）。制剂配制见参考文献。Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶cDNA探针的制备：所采用的3个质粒分别是含有人Ⅰ型前胶原α1链cDNA片段(670bp)的质粒PHCALIU，含人Ⅲ型前胶原α1链cDNA片段(705bp)的质粒PHFS3，以及含胶原酶cDNA片段(1.7kb)的质粒PUC19。3种探针的序列、合成、定性在上述文献中有详述。所有质粒都转化在大肠杆菌中，用标准方法扩增，碱裂解法提取质粒，PEG8000纯化质粒DNA，EcoRⅠ对3种质粒进行酶切，使之线性化。用地高辛随机寡核苷酸引物合成均一标记的cDNA探针，并检测标记效果。(三)皮肤成纤维细胞培养：在局麻下分别切取1例22岁女性肢端型SSc患者前臂外侧活动性硬化皮损边缘皮肤以及1例整形外科手术取之青年女性前臂外侧皮肤。按LeRoy法进行皮肤成纤维细胞原代培养并传代增殖。实验选用第3～6代细胞。培养瓶底面积175cm2，待细胞接近融合时，更换培养基，加入丹参药液， 每个浓度重复3瓶。阴性对照组加入DMEM培养基，阳性对照组加入地塞米松使浓度为1μg/mL。加药后24h收获细胞。(四)总RNA的提取和斑点杂交：采用TRIZOL制剂(Life Technologies)，按改良胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA。测定RNA含量，估算其纯度。将RNA点样于硝酸纤维素薄膜上，每点含量20μg。将薄膜在80℃烘箱烘干2h后封入塑料袋中，加入预杂交液(High SDS Buffer)，50℃预杂交1h后改换有探针的杂交液，杂交过夜。第2天取出薄膜，进行洗脱，用Blocking Reagent封闭后，放入含地高辛抗体稀释液中振荡孵育，再洗脱后加入显色液中静置暗处显色，当斑点出现后，适时用TE终止反应。将结果在图像分析仪上进行灰度数字转换。实验数据用t检验进行分析。二、结果(一)丹参对SSc患者皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原和胶原酶mRNA表达的影响测定结果：丹参水溶性提取物丹参注射液、丹参素及原儿茶醛作用于SSc患者皮肤成纤维细胞24h后，对该细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达具有显著抑制作用，对胶原酶mRNA的表达则具有显著促进作用。阳性对照地塞米松(1μg/mL)则对该细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原和胶原酶mRNA的表达均具有显著抑制作用。详见表1。表1　丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达的影响（±s）组别Ⅰ型前胶原mRNA（n=3）Ⅲ型前胶原mRNA（n=3）胶原酶mRNA（n=3）阴性对照107.30±16.18489.50±32.54304.40±24.26地塞米松（1μg/mL）4.99±2.170.89±0.36101.60±12.17丹参注射液　　　5mg/mL13.16±2.5110.22±4.21＊＊2304.14±76.35＊2.5mg/mL22.43±0.59＊42.99±5.11＊820.10±63.25＊丹参素　　　50μg/mL8.23±3.9411.22±2.79＊970.30±53.15＊25μg/mL11.46±1.75＊＊2.15±1.15554.60±34.67＊原儿茶醛　　　100μg/mL12.71±2.63＊＊8.03±3.1＊106.90±8.2250μg/mL22.99±4.47＊369.10±26.68＊522.10±55.77＊25μg/mL16.28±4.36＊253.60±30.25＊1026.36±94.25＊注：表中数值为杂交斑点实际积分吸光度值；丹参制剂与阴性对照比较，P均〈0.01；丹参制剂与地塞米松比较，＊P〈0.01，＊＊P〈0.05(二)丹参对正常人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原和胶原酶mRNA表达的影响测定结果：丹参注射液(5mg/mL)、丹参素(25μg/mL)及原儿茶醛(25μg