大肠杆菌电化学发光传感新方法的研究.pdfVIP

大肠杆菌电化学发光传感新方法的研究 杨海英，杨凯丽，漆红兰，高强，张成孝* (陕西省生命分析化学重点实验室，陕西师范大学化学与材料科学学院 陕西 西安 710062) *联系人：Tel: 029 E-mail: cxzhang@snnu.edu.cn 大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli ）能引起肠道外感染和急性腹泻等多种疾 病，建立其准确快速检测方法具有重要的意义。传统的检测方法包括细菌培养法、 抗体检测法等，这些方法虽然有较高准确性，但实验周期长，操作繁琐费时。生 物传感器具有灵敏、快速、简便等优点，已发展了基于光学、电化学、荧光法等 微生物传感器用于微生物快速测定和相关研究[1] 。电化学发光法(Electrogenerated chemiluminescence, ECL)具有高灵敏、仪器简单、响应快和易于控制等优点。已 有基于Ru(bpy)32+标记抗体夹心式酶联免疫电化学发光法检测E. coli O157:H7， 虽然方法灵敏度较高，但是，操作繁琐费时。基于糖-凝集素识别反应快速检测 大肠杆菌的电化学发光生物传感器未见报道。 本文基于Con A 与E. coli 外膜上脂多糖 (Lipopolysaccharides, LPS)特异性结 合，构建了一种电化学发光生物传感器，建立了电化学发光法测定大肠杆菌的新 方法。将我们合成的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS (Ru1-NHS)，与Con A 赖氨酸上氨基共 价结合，合成了钌联吡啶衍生物标记的Con A，作为电化学发光探针Ru1-Con A 。 通过滴涂法将羧基化碳纳米管修饰在石墨电极表面，用EDC/NHS 活化羧基，共 价结合Con A 上的氨基，将Ru1-Con A 固定在碳纳米管功能化的石墨电极表面， 制备了检测大肠杆菌的电化学发光生物传感器。当检测的目标物存在时，所制传 感器的电化学发光强度降低。 用紫外可见分光光度法对合成的Ru1-Con A 进行表征，结果表明Ru1-NHS 成功标记于Con A 上，根据Ru (II) λ ~ 457 nm 和Con A λ ~ 280 nm 吸光度 max max 值计算得到nCon A : nRu(II)标记率为1:5。以交流阻抗技术在铁氰化钾平衡电对中表 征传感器的组装过程，当碳纳米管吸附在石墨电极表面后传感器阻抗值减小，通 过共价键固定Ru1-Con A 于羧基化碳纳米管上后，由于Con A 对电子传递的阻 碍作用使阻抗值增大，试验结果表明电化学发光探针已固定于电极表面，成功构 建了电化学发光生物传感器。 采用单阶跃电位激发电化学发光信号，由于传感器与目标物的结合时间和单 阶跃电位是影响传感器灵敏度的重要因素，因此对实验条件进行优化。在+1.2 V ~ +1.50 V (vs. Ag/AgCl 饱和KCl, 脉冲宽度30s)之间考察电化学发光信号强度随 电位值的变化，结果表明当电位为+1.35 V 时，电化学发光信号值最大；考察传 感器电化学发光信号强度随传感器与目标物结合时间的变化，试验发现随着结合 时间增加，电化学发光信号值不断降低，当反应60 分钟时发光信号达到平台， 随反应时间增加而不再变化，表明Con A 与脂多糖的反应达到饱和。因此，选择 传感器与目标物的结合时间为60 分钟，单阶跃电位为+1.35 V 。 在优化的实验条件下对所制传感器的分析性能进行评价。结果表明，该传感 器电化学发光信号的降低值随着E. coli 浓度增大而增大，发光强度降低值与E. coli 浓度对数的线性范围为5.0 × 102 5 −1 ~ 5.0 × 10 cells mL ，RSD 为5.6 % (n=3)， -1 。基于E. coli 脂多糖和凝集素Con A 相互作用的石英晶 检出限为115 cells mL