凡纳滨对虾血蓝蛋白凝集活性及其作用机理的研究.pdfVIP

兰!：兰兰 全竺苎：!兰兰苎±兰!!查兰!±叁竺竺苎苎 !竺!竺兰 从本研究可以初步得出结论，本实验室研制的新型海洋纤溶酶由于纯度好，分子量小，血栓溶解 效率高，对细胞膜损伤小，是一种潜在的第三代溶栓药物，值得深入研究。 凡纳滨对虾血蓝蛋白凝集活性及其作用机理的研究’ 、 章跃陵，林伯坤，严芳，胡忠 (汕头大学理学院生物学系广东汕头515063) 摘要：近年来研究表明血蓝蛋白是f种多功能蛋白，尤其是血蓝蛋白及其降解片段具有酚氧化物酶、 抗病毒和抗细菌等多种免疫学活性．但迄今为止，其凝集活性及其作用机理等尚不清楚。本研究以凡 制实验，生物信息学，基因克隆与表达等方法探索血蓝蛋白的凝集活性及其作用机理。结果发现，血 蓝蛋白对大肠杆菌Escherichiacoli、副溶血弧菌Vibrio fluvialis、哈维氏弧茵I?brio alginolyticus、河弧茵Iqbrio harveyi和嗜水气单胞茵,leromonahydrophila 部抑制．在此基础之上，选用大肠杆菌外膜蛋白和血蓝蛋白亚克隆重组表达蛋白进一步探索血蓝蛋白 凝集活性机理．结果显示，大肠杆菌外腹蛋白可明显抑制血蓝蛋白凝集反应，同时含血蓝蛋白lg-like 区的原核表达蛋白具有凝集活性。而不舍lg．1ike区的原核表达蛋白则无凝集活性．由此推测，血蓝蛋 白确实具有凝集活性，其凝集反应机制可能是血蓝蛋白通过其Ig-like区与细菌外膜蛋白相互作用的结 果，对进一步研究血蓝蛋白的非特异性免疫机理具有重要意义。 ’ 关键词：凡纳滨对虾；血蓝蛋白；细茵；凝集活性；机理 血蓝蛋白是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白。一般认为。血蓝蛋白的主要生物 学功能与机体内的输氧有关，它与血红蛋白和蚯蚓血红蛋白并称为动物界3种呼吸蛋白。但近年来研 究表明，血蓝蛋白不仅具有输氧功能，而且还与能量的贮存，渗透压的维持，蜕皮过程的调节．表皮 的固化以及黑色素的合成有关ll-zJ。特剐Bl起学术界重视的是，血蓝蛋白及其降解片段还具有酚氧化 物酶活性、抗病毒和抗细菌等多种免疫学功能[3-41，被认为是一种具有多种非特异性免疫活性的多功 能蛋白。然而迄今为止，国内、外尚无有关血蓝蛋白凝集活性及其作用机理的报道。为此，本研究采 用现代免疫学和分子生物学方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白的凝集活性及其作用机理，为进一步研究血 蓝蛋白的抗菌机理和探索对虾疾病的免疫学防治途径提供科学依据。 l材料与方法 1．1实验材料 凡纳滨对虾购于汕头鸵浦农贸市场。实验菌(大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、哈维氏弧菌、河 弧菌和嗜水气单胞菌)由厦门大学生物化学与分子生物学实验室馈赠。 1．2主要实验方法 1．2．1血蓝蛋白的纯化与鉴定 采用章跃陵等报道的方法进行口1。 I．2．2血蓝蛋白凝集实验 基空璜日：广东省自然科学基奎资助项目l博士启动基空) 砭宁·土t 奎■唪耳t●t禾与瘁耳焉●学术奎议论文毒200瞄．2．6 分别用LB或肉汤培养基培养大肠杆菌、副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、哈维氏弧菌、河弧苗和嗜水 x108 气单胞菌并制备细闰悬液(1 CFU／mL)．采用玻片凝集法进行血蓝蛋白凝集实验，其中对照组为 TBS-Ca2．．实验组用TaS-Ca2+将血蓝蛋白进行2倍梯度稀释。 1．2．3血蓝蛋白凝集抑制实验 分别选取a-D．葡萄糖、n半乳糖、n木糖、n山梨糖、蔗糖、麦芽糖、ct-D．乳糖、甘露醇和N． 乙酰神经氨酸等9种糖和大肠杆菌外膜蛋白配成不同浓度梯度的溶液按常规方法进行血蓝蛋白凝集抑 制分析． 1．2．4血蓝蛋白亚克隆原棱表达蛋白凝集活性分析 根据凡纳滨对虾∞itopenaeus 载体相连构建重组表达予，最后进行原核表达与蛋白分离纯化以用于凝集实验分析。 2结果与讨论 2．1血蓝蛋白凝集活性分析 选取大肠杆菌等6种细菌探索凡纳滨对虾血蓝蛋白凝集活性，结果发现血蓝蛋白与6种细菌均能 发生凝集反应，其凝集活性为0．27～1．08