一种经济, 简单与微生物基因组DNA 与提取方法.docVIP

一种DNA的1. 中南大学基础医学院，湖南 长沙 410083；2.410083 关键词：DNA提取A 文章编号：1672-2175（2005）06-0945-02获得一定浓度和纯度的DNA是进行分子生物学研究的基础[1]。破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA的前提，而蛋白质和核酸物质的分离是获得高质量DNA产物的关键。目前，主要采用的破壁方法有：冷冻研磨法[2]、溶菌酶法[3]、EDTA法[4]等，这些方法一般采用复杂的裂解液体系，并借助蛋白酶K和RNA酶的帮助来获得高质量的抽提产物。由于细胞裂解体系不仅配制十分麻烦，而且部分药品有毒操作危险性大，此外部分药品及相关酶试剂价格昂贵。本文充分利用DNA自身可变性与复性的特性[5]。以无菌的SDS（/c =20%）NaCl（/c =8%）60℃和72℃水浴DNA复性RNA、蛋白质和细胞壁碎片等杂质降解或沉淀，从而获得高质量的DNA产物。具体做法如下：0.05~0.2 g样品的5 mL EP管中加500~2000 μL裂解液，充分混匀，立即放入沸水浴中并开始计时5~20 min（细胞壁薄且壁外没有荚膜或多糖的微生物，沸水浴时间一般5~10 min；对于那些细胞壁厚或有特殊胞外结构的微生物及杂质含量高的样品，沸水浴时间一般15~20 min），每隔2~3 min颠倒EP管3次；随后立即转入60 ℃水浴中水浴1 h或更长，每隔15 min颠倒EP管3次；接着转入72 ℃水浴中水浴1 h或更长，每隔15 min颠倒EP管3次。 （2）抽提：向EP管中加入等体积的V（氯仿）∶V（异戊醇）= 24∶1，上下倒转溶液15 min后，随后室温静置10 min，接着12000 r/min离心3，上清EP管中并重复该步骤一次。：2.5倍体积－20 ℃冷冻的无水乙醇，上下倒转溶液数次后，放入－20℃或4 ℃冰箱中沉淀1 h或更长。沉淀完毕后12000 r/min离心15EP中加入φ=70%的乙醇2 m10 min，12000 r/min离心5干燥沉淀物，加适量洗脱沉淀，洗脱液即为DNA提取液此法简便、、可用于用于16SrDNA、18SrDNA23SrDNA等多种基因的扩增。 参考文献： [1] 张宁中国海洋药物2004(2): 40－46. ZHANG NING, WANG FENGSHAN. Advances of DNA extraction methods[J]. China J Mar Drugs, 2004(2): 40－46. [2] ZHAO XIAOMIN, DONALD W DUSZVNSKI, ERIC S LOKER. A simple method of DNA extraction for Eimeria species[J]. Journal of Microbiological Methods, 2001, 44: 131－137. [3] ZHOU JIZHONG, MARY ANN BRUNS, JAMES M TIEDIE. Recovery from soils of diverse composition[J]. AEM, 1996, 2: 316－322. [4] SAMBROOK J, Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Mannu [M]. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: 360－364, 1570－1580. [5] 王镜岩 生物化学(下)[M]第3版 北京高教出版社, 2003 157－382. WANG JINGYAN, ZHU SHENGGENG, XU CHANGFA. Biochemistry (The Last Volume) [M]. 3rd edition. Beijing: China Higher Education Press, 2003: 157－382. An economical and simple method for DNA extraction from microorganisms ZENG Le-ping1，ZHOU Hong-bo2，HUANG Ju-fang1 1. School of Basic Medical Sciences, Central South University, Changsha, 410083 China; 2. School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha, 41008