核酸的定量测定——定磷法 .pptVIP

实验十八 脂肪酸的β-氧化Exp.18 β-Oxidation of Fatty acid 一、实验原理 在肝脏中，脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。反应式如下： 2NaOH +I2─→NaOI +NaI +H2O CH3COCH3 +3NaOI ─→CHI3（碘仿）+CH3COONa +2NaOH 剩余的碘，可以用标准硫代硫酸钠滴定。 NaOI +NaI +2HCl ─→I2 +2NaCl +2H2O I2 +2Na2S2O3─→Na2S4O6 +2NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。 二、实验用品 1、材料 新鲜动物肝脏 2、试剂 　（1）Locke氏溶液：将NaCl 0.9g，KCl 0.042g，CaCl2 0.024g，NaHCO3 0.015g和葡萄糖0.1g溶于水中，稀释至100ml。 （2）0.5N丁酸溶液：取45ml正丁酸，用1N NaOH液中和至pH=7.6，并用水稀释至1000ml。 （3）1/15M磷酸缓冲液（pH7.6）： ①1/15M KH2PO4：称9.78g KH2PO4溶于重蒸馏水，稀释到1000ml； ②1/15 M Na2PO4：称11.876g Na2PO4·2H2O溶于重蒸馏水。稀释到1000ml。 　 如无Na2PO4·2H2O可将新结晶的Na2HPO4·12H2O在室温下空气干燥2~3星期，然后使用； 取②86.8ml，① 13.2ml混匀即可得1/15M磷酸缓冲液（pH7.6）。 （4）15%三氯醋酸液 （5）10%NaOH液 （6）0.1碘溶液：称取12.7g碘和25g碘化钾溶于水，稀释至1000ml，混匀后，用标准0.1N Na2S2O3溶液标定。 （7）10%HCl液 （8）0.1%淀粉液 （9）0.1N标准Na2S2O3液 3、仪器设备 玻璃皿、5ml锥形瓶、试管及试管架、2 ml及5 ml吸量管、漏斗、剪刀和镊子、5 ml微量滴定管、天平、恒温水浴 　 三、方法和步骤 1、用重物击毙动物（家兔、大白鼠或豚鼠），并迅速将血放尽，取出肝脏，在玻皿上剪成碎糜。 2、取50 ml锥形瓶两个，各加入3 ml Locke氏溶液和2 ml pH=7.6的磷酸缓冲液。在其中一个三角瓶内加入3 ml 0.5N丁酸液，另一瓶加入3 ml蒸馏水作对照。并于两瓶中分别加入0.5g肝糜（两分要等重），混匀，在37℃恒温水浴中保温2小时。 3、保温毕，取出锥形瓶，各加入2 ml三氯醋酸，在对照瓶中加入3 ml 0.5N丁酸，在样品瓶加入3 ml H2O混匀，静置15分钟，过滤。 4、另取两锥形瓶，分别量入5 ml滤液，5 ml 0.1N碘液和5 ml 10%NaOH液，摇匀后，静置10分钟。加入5 ml 10%盐酸液中和，用0.1N Na2S2O3液滴定剩余碘，滴至浅黄色时，加入3滴淀粉液作指示剂，摇匀后并继续滴到兰色消失。 5、记录滴定样品与对照所用Na2S2O3的毫升数。 四、实验结果 计算样品中丙酮的含量（X） X=（B－A）×0.9667×13÷5 式中： X=样品中丙酮含量； B=滴定对照液所消耗Na2S2O3液ml数； A=滴定样品液所消耗Na2S2O3液ml数； 1ml 0.1N Na2S2O3液相当于0.9667mg丙酮。 注意事项 肝糜必须新鲜，放置过久则失去氧化脂肪酸的能力。 五、思考题 1、什么是酮体？ 　２、本实验如何计算样品中的丙酮含量？　３、为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中丙酮的含量？   * * 六、参考文献 　现代生物学基础实验指导,林宏辉等,四川大学出版社,2003 *