质粒DNA的提取03014.pptVIP

实验目的 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、学习提取质粒DNA的操作步骤。 熟练移液器的使用。 实验原理 1.质粒是独立于染色体外的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子。 2.分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 实验材料、仪器和试剂 1.实验材料 大肠杆菌DH5α 2.仪器 1.5mL Eppendorf管30个 微量加样器 台式高速离心机 操作步骤 1.培养细菌 将带有质粒pUC19或pBR322的大肠杆菌接种在LB琼脂培养基或液体培养基上，于37 ℃培养24h—48h。 * 质粒DNA的提取 主讲人： 采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，SDS可使细胞壁裂解，经溶菌酶和SDS处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。将上清液用乙醇沉淀后洗涤，可得质粒DNA。 3.试剂 pH8.0G.E.T缓冲液：50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HCl,用前加溶菌酶4mg/mL。 pH4.8乙酸钾溶液：60mL50mol/KAc、11.5mL冰醋酸、28.5mL蒸馏水，该溶液中钾离子浓度为3mol/L。 酚-氯仿混合液（体积比1:1）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其体积分数为0.1