酵母醇脱氢酶的提取及专一性测定51144.pptVIP

* * 酵母醇脱氢酶的提取及 专一性测定 一、实验目的 掌握醇脱氢酶的提纯的原理和方法。 二、实验原理 以酵母为原理，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白等方法，提取具有一定纯度的醇脱氢酶，注意每一步提纯均需测定蛋白含量及酶活力。 醇脱氢酶的辅酶NAD （过量）CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO+NADH+H+ 当醇过量时，NAD+被还原速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多，后者对340nm有较强吸收；通过测定NADH含量，得知酶活力大小。 三、实验器材 37℃，55℃水浴 紫外-可见光分光光度计 ，石英比色皿 冰浴 离心机 ，离心管 透析袋（截留分子量5000-10000Da） 四、实验试剂 1. 酵母 2. 3M 乙醇 3. 0.06M 焦磷酸钠（pH 8.5） 4.0.0015M NAD 5.0.01M K2HPO4 6. 丙酮 （预冷） 7. 0.066M Na2HPO4 五、实验步骤 （一）提纯酵母醇脱氢酶 1. 粗提 取20g干酵母于250ml烧杯中，加80ml 0.066M Na2HPO4，37℃保温2小时，不断搅拌，室温再提取3小时，4000rpm，离心20min，量取上清液V1，留2ml上清测蛋白含量及酶活力。 2. 热变性去杂蛋白 将剩余上清55℃加热15-20min，