研究方法和手段.docVIP

研究方法和手段 显微技术 (1)原理：利用一组透镜将标本连续放大 （2）最大分辨率：0.2um 1. 普通光学显微镜 (3)分辨率或分辨力：在人的明视距离25cm处，能清楚的分辨两点的最小间距的能力，用R来表示 R=0.61入/nsina (4)标本的制备： 取材→固定→包埋切片→染色→观察 （甲醇,戊二醛，乙醇）↓ ↑直接涂片（固定） 2.相差显微镜 (1)利用光的衍射和干涉效应 (倒置相差显微镜) (2)应用：主要观察活细胞 光学显微镜 3.微分干涉显微镜 (1)光源：紫外光 4.荧光显微镜 (2)标本内的荧光分子：1.标本自身含有荧光物质 2.用荧光物质标记标本 (3)检测细胞表面或细胞内特定的抗原 5.激光扫描共聚焦显微镜 ：（1）应用：荧光检测 细胞结构的三位重建 成像原理：电子束穿透样本而成像 1 .透射电子显微镜 应用：观察细胞内部超微结构 电子显微镜 标本的制备：固定→包埋→切片→染色（重金属盐）→观察 2.扫描电子显微镜 成像原理：极细的电子“探针”扫描样品表面，收集二次电子成像 主要应用：主要观察样品的表面结构 扫描探针显微镜 细胞的分离和培养 1.从组织中分离 细胞的分离方法： 1）破环胞外基质和细胞间的连接 蛋白酶消化 机械剪切 细胞悬液 单一种类细胞 消化，机械并用 2）皮肤瘢痕 成纤维细胞 3）小鼠胸腺 T细胞 4）大鼠骨髓 骨髓间质干细胞 5）平滑肌 平滑肌细胞 2.细胞分选 1.分选细胞 应用： 2.细胞表面型分析 3.染色体分析 4.DNA分析 3.细胞培养 概念：在一定的营养条件下将细胞在体外践行培养，使之继续生长增殖的过程。 培养容器 培养基 基本材料与器材 血清 CO2培养箱 超晶工作台 倒置显微镜 1. 需要营养 2.适宜的温度，湿度 细胞体外生长的条件 3.适宜的pH值 4.无菌的环境以及支持物 原代培养（primary culture cell）：直接从集体去下细胞，组织和器官后立即进行培养。 传代培养（subculture cell）：浆细胞按一定的比例转瓶扩大培养 细胞系（cell line）：原代培养的细胞经传代成后就叫细胞系。 细胞株(cell strain): 细胞系中挑出一个细胞，培养形成的克隆。 三.细胞组分的分级分离 电泳 破环细胞膜 匀浆 离心 层析 低渗 超声震荡 机械研磨 离心分离技术：分离细胞器，生物大小分子常用的技术，根据各种颗粒或大分子的大小，密度的不同进行分离。