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PCR引物设计法则、特殊PCR技术、PCR产物电泳结果分析和经验总结PCR引物设计的11条黄金法则一、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。二、引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA /yp/product-list-473.html聚合酶进行反应。三、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡/yp/product-list-674.html核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡/yp/product-list-674.html核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。四、引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端