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降低氧化应激反应调节利托那韦副作用的研究 雷伯开 金方 （上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437 ） HIV蛋白酶抑制剂（PI ）利托那韦（RTV ）能够明显抑制HIV病毒的复制， 延长患者生存。但给予RTV治疗的患者出现了众多的毒副反应，最主要的是血脂 代谢异常。在HIV感染患者中，心血管疾病是引起死亡的4大因素之一。其副作 用机制的研究受到了广泛关注，发现RTV能够引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress ）、诱导炎症因子（肿瘤坏死因子TNF-α、白介素-6等）释放、氧 化应激（oxidative stress ）、诱导脂质合成蛋白表达升高等，这些相关机制均与血 脂代谢异常密切相关，但降低副作用的研究仅见个别报道。研究发现，氧化应激 间接或直接的参与了药物所致副作用，可以推测，降低氧化应激反应能够改善副 作用。采用抗氧剂来降低氧化应激，进而改善血脂异常等具有切实可行性。 自微乳给药系统能够显著提高药物溶解度，且制备工艺简单，在胃肠道消化 液及肠道蠕动下即可自发形成微乳，个体差异性小，成为较理想的RTV新型给药 系统。 1 仪器和药品 Agilent 液相色谱仪（美国安捷伦公司）；CO2 细胞培养箱（美国赛默飞 公司）；生物安全柜（美国Nuaire 公司）；Wallac 1420 多功能全波长读板仪 (美 国 PerkinElmer 公司) ；Bio-Rad 凝胶电泳仪(美国 Bio-rad) ；倒置显微镜（日本 olympus ）；离心机 （德国eppendorf 公司）。 维生素C 和E 、亚油酸乙酯、油酸、DCFH-DA （2,7-dichlorofluorescein diacetate ）均购自sigma-aldrich；抗C/EBP-homologous protein (CHOP)抗体，抗 Lamin B,抗体，均购自Santa Cruz 公司；Bio-Rad 蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad 公司，cremophor EL （德国basf 公司）；DMEM 培养液（美国invitrogen 公司）。 2 实验与方法 2.1 ROS 测定 用DCFH-DA 测定细胞内ROS ，其原理为DCFH-DA 扩散通过细胞膜，被细 胞内的酶水解成为DCFH ，在ROS 存在的情况下被氧化成有荧光特性的DCF ， 极性大，不能透细胞膜而留在细胞内，测定细胞内的荧光强度反映ROS 水平。 测定的激发波长为485 nm ，发射波长为520 nm。 巨噬细胞培养于12 孔板，至80%饱和度时给药，孵育4h 后，移除培养液， 用 PBS 冲洗细胞 2 次，每个孔加入 1ml 用不含血清的 DMEM 配成的 10µM DCFH-DA ，培养箱中孵育30min 后，用冷PBS 缓冲液冲洗2 次，收集细胞，一 部份用于蛋白浓度测定，一部份用裂解液（0.1M NaOH ，50% 甲醇配制）裂解， 细胞裂解液经5000r/m 离心5min，取上清液200µl 到96 孔板，于荧光分析仪测 定荧光强度，并用所测得的细胞蛋白浓度进行矫正。 2.2 内质网应激-CHOP 蛋白测定 HIV PI 能诱导细胞内质网应激，刺激凋亡蛋白CHOP 合成。将细胞培养于 60mm 培养皿，待细胞长至80%饱和度后，给予不同药物处理4h 后，收集细胞， 提取细胞核蛋白，制备蛋白样品用于凝胶电泳分离CHOP 及内参Lamin B 蛋白， western blot 法进行蛋白定量。 2.3 ELISA 测定炎症因子 巨噬细胞于24孔培养板，给药24h后，收集细胞培养液，ELISA法测定其中 炎症因子浓度，并收集细胞测定蛋白浓度，将炎症因子对蛋白浓度进行矫正。 2.4 RTV 溶解度 取5ml PBS （pH 7.4 ）、0.1M HCL于10ml具塞试管，另取1ml不同的油于10ml 具塞试管，加入过量RTV ，置于室温25ºC 、37ºC恒温水浴振荡24h后，3000r/m离 心5min去除不溶药物，取上清液用0.45µm滤膜过滤后，续滤液适量用乙腈稀释 后，HPLC测定浓度。 2.5 油水分配系数测定