开展FPTB试验的基本试验条件.docVIP

FASTPlaqueTB操作卡 1. 实验条件 需准备标本类型：初诊疑似病人痰标本、胸腹水、脑脊液、尿液；菌株标本或结核复发病例且已停用抗痨治疗后标本。 所需仪器及耗材：生物安全柜、离心机（4000rpm）、漩涡振荡器、水浴箱（56℃）、离心管（50ml）、三角瓶（300ml，500ml）、平皿（90mm）、移液枪及配套枪头（100ul，1000ul）。 2. 实验流程 实验准备 1、高压灭菌 A液(FPTB Medium)：加A粉于270 ml（请依照该药粉袋上标注加水）蒸馏水中溶解，121℃灭菌10分钟； G液(FPTB Agar)：加G粉于60 ml蒸馏水中溶解，121℃灭菌10分钟； 蒸馏水(5ml)；枪头(100ul，1000ul)；移液管(若干)。 2、C液：将B液（Supplement）加入已冷却的无菌A液中混匀即为C液。 3、配制NALC-NaOH（或3％NaOH）消化液：用蒸馏4%氢氧化钠溶液和2.9%枸橼酸钠溶液，在高压锅121℃ 15min无菌消毒后，储存在30℃以下。配制好4%NaOH和2.9%枸橼酸钠1:1的混合液。将0.5g的N-乙酰-L-半胱氨酸粉末加到100ml的溶液中（0.5%w/v）。NALC一旦被加进去此溶液在2～8℃可稳定保存24h（根据实际的使用情况而配制量）。 步骤1——痰液标本处理 1.取1~3ml痰液于50 ml无菌有盖离心管中，加1~2倍体积的NALC-NaOH（或3％NaOH）消化液； （胸腹水同痰液；尿液4000 rpm离心15分钟取沉淀后同痰液；菌株在1个麦氏浓度基础上稀释1000倍） 2、旋涡振荡打散痰液，室温孵育15分钟； 3、加20ml C液悬浮沉淀物，4000 rpm离心15分钟，弃去上清液； 4、加1 ml C液，重悬沉淀物，无菌条件下转移至反应管中。 步骤2——试剂配制（配制试剂前请确保试剂恢复室温） D液(Actiphage)：加1.1ml无菌C液于试剂D瓶中，溶解； E液(Sensor Cells)：加11 ml无菌C液于试剂E瓶中，溶解； F液(Virusol)：加5 ml无菌蒸馏水于试剂F瓶中，溶解； ——质控制备 阴性对照：吸取1 ml C液于反应管中，为“阴性对照”； 阳性对照：取50ul E液，用C液稀释106倍，随后取1ml该稀释液于反应管中，为“阳性对照”。 步骤3——检测（无菌条件下操作） 1、分别加100ul试剂D溶液于阴、阳性对照及标本的反应管中，轻轻摇晃，37℃孵育60分钟； 2、分别加100ul试剂F溶液于各反应管中，上下颠倒、旋转充分混匀，确保杀病毒剂与反应管内壁完全接触，置于室温5~7分钟(严格控制时间，不能超过7分钟)； 3、分别加5ml C液于各反应管中，颠倒混匀(可直接倒入反应管中部位置的指示处)； 4、分别加1ml试剂E溶液于各反应管中，颠倒混匀； 5、立即加5ml冷却至55±2℃的试剂G于各反应管中(可直接倒至反应管约管口处)； 6、快速将全部内容物分别倒入相应的空的无菌培养皿中，置于室温定型； 7、将定型好的平皿放于37℃培养箱中培养，18~24小时后判读结果。 3. 判读结果 对照组： 阴性对照 10噬菌斑，阳性对照≥ 20噬菌斑 实验组： 阴性结果 ≤19噬菌斑，阳性结果≥ 50噬菌斑 可疑阳性结果：20~50噬菌斑