几丁质酶基因克隆和在伯克氏菌中表达.docVIP

(中国生物防治，2006年, 22（增）：72-77) 芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析 及其在伯克氏菌B418中的表达 黄玉杰1 杨合同12( 周红姿1 李纪顺1 吴远征1 扈进冬1 1 山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室，济南 250014； 2 山东理工大学生命科学学院，淄博 255049 采用PCR技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列。片段共2227bp，含有一个具有1788个核苷酸的开放阅读框架，起始密码子位于211bp，终止密码子位于1998bp，共编码氨基酸605个。序列比较发现同已发表的Bacillus subtilis几丁质酶核苷酸具有99.39%的同源性。将该基因与大肠杆菌－伯克氏菌穿梭质粒pRK415连接，获得重组质粒pRChi113。重组质粒电击转入伯克氏菌B418中，获得工程菌株B418-9、B418-13。与野生菌株相比，平板拮抗实验表明，工程菌株对Verticillum dahliae、Rhizoctonia solani、Helminthosporium sativum、Rhizoctonia cerealis抑菌效果明显提高。 关键词 几丁质酶 克隆 转化 伯克氏菌 几丁质酶（EC3.2.1.14）是催化降解几丁质的一类糖基水解酶，它可将由β-1,4-N-乙酰-D-葡聚糖（NAG）残基组成的几丁质降解为低分子量的NAG[1]。几丁质酶广泛存在于有机物中，这些有机物本身可能不产生几丁质，例如细菌、真菌、昆虫、高等植物（PR蛋白）和动物等，对防治病原真菌具有重要的作用。顾真荣[2]曾报道三种产几丁质酶的芽孢杆菌（短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌）对病原菌的抑菌作用。 本实验室从小麦根际土壤中分离到了具有几丁质酶活性的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Ap113。通过设计引物获得几丁质酶编码基因，并进行序列分析，并将该基因利用电击方法导入到具有固氮、解磷、解钾，促进植物生长作用伯克氏菌B418中，以提高该菌的生防效果，为生产高产几丁质酶工程菌株奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒 见表1 表1 细菌菌株和质粒 Table 1 Bacterial strains and plasmids Strains/Plasmids Characteristics Source B.subtilis Ap113 具有几丁质酶活性 Store in this lab Burkholderia B418 具有解磷、解钾、促进植物生长作用 Store in this lab E.coli DH5α EndA1,hsdR17，thi-1,relA1,gyrA,recA1, △80LacZM15，△（LacZYA-argF）U169 Store in this lab pMD18-T Ampr 购自Takara pMChi113 Ampr，携带几丁质酶基因 本室连接重组获得 pMSDChi113 Ampr，携带几丁质酶基因，并在几丁质酶基因前具有SD序列 本室连接重组获得 pRK415 Ampr，Tetr 中国农业大学张力群惠赠 pRChi113 带有几丁质酶基因片段 本室连接重组获得 1.1.2 培养基 B418固体培养基(g/L)：K2HPO4 0.5，MgSO47H2O 0.2，NaCl 0.02，CaCl2 0.2，NaMoO42H2O 0.002，乙二胺四乙酸铁钠盐 0.066, 谷氨酸钠 0.05,葡萄糖 5,琼脂 15,pH 7.2-7.4 B418液体培养基(g/L):胰蛋白胨 10,酵母浸出物 1, CaCl2 0.2，pH 7.2-7.4 大肠杆菌培养基LB、SOC见参考文献[3] 几丁质培养基见参考文献[4] 1.1.3 酶和试剂 各种限制性内切酶、T4DNA ligase等分别购自上海生工、TaKaRa Biotech公司，DNA凝胶回收试剂盒购自TaKaRa Biotech公司，DNA片段回收试剂盒购自上海生工。X-gal、IPTG购自TaKaRa Biotech公司。 1.2方法 1.2.1 几丁质酶酶活性测定：见文献[5] 1.2.2 染色体DNA的提取与纯化：参照《精编分子生物学实验指南》，并做一定的修改 1.2.3 几丁质酶编码基因引物的设计及PCR：根据GeneBank上有关芽孢杆菌几丁质酶编码基因的碱基顺序，采用软件Primer Premier设计引物，PCR反应条件及反应程序参照《精编分子生物学实验指南》[3]进行，其中55℃复性60sec，共35个循环。扩增反应完成后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果。 Chi113up:5’-CCACATACGGTTTGAA