DNA克隆载体的“三片段克隆法”改造策略.pdfVIP

维普资讯 第 30卷第 4期 南京师大学报 (自然科学版) Vo1．30No．4 2007年 12月 JOURNALOFNANJfINGNORMALUNIVERSITY(NaturalScienceEdition) Dee，2007 DNA克隆载体的 “三片段克隆法改造策略 谢 锋，朱 蕾，尚广东 (江苏省生物多样性和生物技术重点实验室，江苏 南京 210046) [摘要] 将一个或多个DNA片段克隆至载体是分子生物学研究中最常用的技术之一．本研究使用新颖的 Red／ETDNA重组克隆技术原理一步法将结合转移片段oriT，阿普霉素抗性基因Am和链霉素抗性基因(rpsL) 克隆至常用的克隆载体pBluescriptKS(一)，同时去除载体的氨苄青霉素抗性基因 (bla)．此 “三片段克隆法”简 便，快速，避免了经典的克隆策略常常难以寻找合适的限制性内切酶，长片段PCR、暴露于紫外线和凝胶回收等 步骤所可能引入的碱基突变等等难以克服的问题，有可能成为通用的克隆策略．所得到的结合转移载体在通过 结合转移将外源片段从大肠杆菌等转移至放线菌方面将有着广泛的用途． [关键词] 重组工程，三片段克隆法，结合转移载体 [中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]1001-4616(2007)04-0080-04 A GeneralM ethodforDirectDNA VectorM odification XieFeng，ZhuLei，ShangGuangdong (JiangsuKeyLaboratoryforBiodiversityandBiotechnology，Nanjing210046，China) Abstract：CloningoneormoreDNA fragmentsintoavectoristheoneofmostcommonlyusedtechniques inmolecularbiology．Classiccloningstrateyg ，whendeahwithcomplicated cloningsteps，likemultiple fragmentsinsertion，selectivemarkerexchange，areoften troubledbythechoiceofrestrictionenzymes， thebasemutationscausedbylongfragmentPCR，UV exposureandgelpurification．Wemadeuseofthe Red／ETtechnoloyg toclonetwofragmentsintothevectorwhileremovetheunnecessaryvectorpartina singlestep．Thisthreepiecescloningmanipulationisstraightforwardandconvenient，withthepotentialto beageneralcloningstrateyg forvectorengineering． Keywords：recombineering，threepiecescloning，conjugaltransfervector 0 引言 DNA载体的改造，如DNA片段的插入以及抗性基因的置换等是分子生物学的基本操作，它也是以后 的生物化学和遗传学研究的基础． 传统的克隆策略是：将载体和外源片段以限制性内切酶作用以产生相同或互补的粘端或钝端；T4连 接酶介导的DNA分子间的连接；大肠杆菌感受态细胞的转化；抗性菌落的生长、培养；质粒提取、鉴定等． 与PCR技术