绿色木霉中纤维素酶相关基因的克隆、定点突变及其真核表达.pdf

摘 要 纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源，有效利用纤维素资源，可以缓解世界范 围内日益突出的粮食和能源短缺问题。纤维素酶通过纤维素酶中三种组分：内切葡聚糖 苷酶（endoglucanase，EG ），外切葡聚糖苷酶（cellubiohydralases ，CBH ），以及β-葡萄 糖苷酶（β-glucosidases，BG ）的协同作用将纤维素水解为葡萄糖。纤维素酶的酶活力影 响着纤维素酶在工业生产中的应用，运用基因克隆、基因表达、纤维素酶蛋白分子的改 造和设计等手段获得人们所期望的高酶活的纤维素酶成为研究热点。绿色木霉 （Trichoderma viride）是产纤维素酶活性最高的菌株之一，它在自然界分布广泛，常腐 生于木材、种子及植物残体上。白蚁（Coptotermes formoscmus）以朽木等富含纤维素的 木质性物质为食，肠道微生物中富含纤维素降解菌。 本论文从室外多年放置的朽木中分离得到可分解纤维素的真菌G-1 ，从白蚁肠道微 生物中分离得到可分解纤维素的真菌G-2，经过菌落形态和菌丝形态观察及18Sr DNA序 列分析鉴定真菌G-1，G-2为绿色木霉（Trichoderma viride）。从G-1 中克隆得到内切葡聚 糖苷酶基因（EG Ⅱ, Genbank:HM116999.1 ）和外切葡聚糖苷酶基因（CBH Ⅱ, Genbank:HM117000.1 ），从G-2 中克隆得到两个β-1，4-葡萄糖苷酶基因（BG Ⅰ, Genbank: HM178944.1 ；BG Ⅱ, Genbank: HM178945.1 ）。根据序列比对分析，对克隆到的EG Ⅱ和 CBH Ⅱ基因序列进行定点突变，得到两条突变序列EG Ⅱ-mut和CBH Ⅱ-mut ，使其编码的 氨基酸序列产生突变，意在增加其表达蛋白的酶活力。 将EG Ⅱ, EG Ⅱ-mut, CBH Ⅱ去掉自身信号肽序列，构建分泌型表达载体pPIC9K-EG Ⅱ，pPIC9K-EG Ⅱ-mut，pPIC9K-CBH Ⅱ，转入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）GS115 进行诱导表达。经MD, MM板筛选得到转化子，用刚果红染色法进进行粗筛，再用DNS 法对酶活性进行测定，筛选得到胞外分泌酶活力较高的重组毕赤酵母菌株GS115-EG Ⅱ -7，GS115-EG Ⅱ-mut-10，GS115-CBH Ⅱ-2 。GS115-EG Ⅱ-7，GS115-EG Ⅱ-mut-10的内切 葡聚糖酶活力分别为20.915U/ml ，24.110U/ml 。GS115-CBH Ⅱ-2 的外切葡聚糖酶活力达 到27.925U/ml 。突变序列（EG Ⅱ-mut ）的重组毕赤酵母菌株比原序列（EG Ⅱ）的重组 毕赤酵母胞外分泌内切葡聚糖酶的酶活力提高了，结果表明某些定点突变可以揭示影响 酶活的重要功能域，为使用分子生物学的方法改造纤维素酶基因以获得高酶活的纤维素 酶奠定基础。 本论文构建了6个酿酒酵母表达载体，pYES2/CT/lacZ-EG Ⅱ, pYES2/CT/lacZ-EG Ⅱ -mut, pYES2/CT/lacZ-BG Ⅰ, pYES2/CT/lacZ–BG Ⅱ, pYES2/CT-CBH Ⅱ, pYES2/CT-CBH Ⅱ -mut ，为后续的工作奠定了基础，即转化酿酒酵母后获得重组菌株，取重组的内切葡聚 糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力最高的酿酒酵母，分别发酵至活性 最高的时间后按照不同比例混合菌液，筛选降解秸秆纤维素速率最快的比例，实现高效 率的纤维素水解和发酵同步进行。 关键词：绿色木霉；纤维素酶；定点突变；毕赤酵母；酶活力 I Abstract ： Cellulose is one of the most abundant renewable resources in the earth; efficient use of fiber resources may alleviate the increasingly serious shortage of food and energy all over the world. Cellulose is hydrolyzed i