两酶活性测定.docVIP

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 一、原理 将25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD定义为一个活力单位。在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。 二、试剂 1、A液：PH8.20 0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（内含1mmol/L EDTA·2Na）。称取1.2114g三羟甲基氨基甲烷和37.2mgEDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/l盐酸溶液中，用蒸馏水定溶至100ml。 2、B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmol/l盐酸溶液，并定容至100ml。 3、盐酸溶液：10mmol/l 4、蒸馏水：二重石英蒸馏水。 三、仪器 1、紫外-可见分光光度计； 2、精密酸度计，0.01PH； 3、离心机； 4、10ml比色管； 5、10ml离心管； 6、玻璃乳钵。 四、测定步骤 1、植物超氧化物歧化酶1.00g置于研钵中，加入9.0ml蒸馏水研磨5分钟，移入10ml离心管。用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000r/min离心15分钟，取上清液测定。 2、在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1Min后吸光度值，二者之差为邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1）为0.060。 3、在25℃左右，于10ml比色管中依次加入20.0ul样液或酶液，A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1分钟后吸光度值，二者之差为样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率△A′325（min-1）。加入样液或酶液的量使抑制邻苯三酚自氧化速率为1/2△A′325（min-1），即0.030。 五、计算结果 SOD活力（u/g）= 式中： V—加入样液或酶液的体积，ml △A325—邻苯三酚自氧化速率 △A′325—样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率 D—样液或酶液的稀释倍数 V1—样液总体积，ml 4.5—反应液总体积，ml m—样液的质量，ml 过氧化物酶（POD）活性的测定 一、目的 过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。 二、原理 在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。 三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制： 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。 反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪ H2O2，充分摇匀）。 四、实验步骤 1. 酶液提取 称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r/ min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定 吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。 五、酶活性计算 按下式计算酶的相对活性 △A470 × 酶提取液总量（ml） 酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时酶液用量（ml）