人cAMP-依赖型蛋白激酶β抑制剂的克隆、表达纯化和性质结构分析.pdf

复旦大学硕士论文 人PⅪD的克隆、表达纯化和性质结构研究 摘 要 cAMP依赖型蛋白激酶(PKA)在许多激素和神经递质的信号传递过程中起着 十分重要的作用。人cAMP依赖型蛋白激酶13抑制剂(人PKl0)能抑制PKA 催化亚基的活性。 通过大规模人类cDNA测序，我们从胎脑cDNA文库中克隆了人PKIp基 因。生物信息学分析表明该基因的cDNA具有1057个碱基，编码具有78个氨 基酸的蛋白，具有两个保守的氨基酸序列：即抑制PKA催化亚基活性的底物类 似物位点区和富含亮氨酸及疏水氨基酸的出核信号(NES)区。蛋白产物的分子 量为8468．2Da，等电点为4．69。将人PKI B的编码框亚克隆到表达载体pETl5 中，在E．coil BL21(DE3)PLYSs菌株中获得了高表达。表达产物经过热处理、 硫酸铵沉淀和DEAE 质(SDS—PAGE电泳显示单一条带)。电喷雾质谱确定了纯化后的蛋白质的分 子量为8468．0Da，说明该蛋白质是人PKIB。活性分析表明该蛋白质对PKA的 比活性是6．0×104 nM。 unit／mg，抑制常数Ki值是0．173 我们还对人PKID进行了结构和功能分析。傅立叶红外光谱、拉曼光谱和圆 二色谱分析结果表明在人PKl0中含有大量的无规卷曲结构、少量的n螺旋和B 折叠。这和前人对该类蛋白质的研究结果一致：维持最少的规则的二级结构可以 B在高温时去折 使该类蛋白质忍受高温和低pH。CD热稳定性研究表明人PKI 叠变性，而在低温时又重新折叠，这可能是该类蛋白质的热稳定机制。利用 B。 Da，说明该蛋白质得到均 电喷雾质谱确定了纯化后的蛋白质的分子量为8572．0 p HSQC二维核磁共振谱表明人PKI ～标记(标记率达到99％以上)。”N一1H 5—8．5 的主链N上=的质子主要集中在7 ppm范围以内，同样说明该蛋白质的 规则的二级结构较少。目前， 对15N一1H HSQC—NOESY等一系列二维谱的分析归属正在进行中。 关键词：人PKI#；电喷雾质谱：傅立叶红外光谱：拉曼光谱：圆二色谱；异核标记 二维核磁共振谱。 复旦大学硕士论文 人PKIp的克隆、表达纯化和性质结构研究 Abstract acommon for proteinkinase(PKA)is many Signalingthrou曲cAMP—dependent pathway cellular formofhuman kinase inhibitor(human 13 cAMP—dependentprotein PKll3) processes．The isoneofthe subunitofPKA． catalytic proteinsthatinhibitthe