蛋白芯片：蛋白表达和抗体筛选的有力工具.docVIP

蛋白芯片：蛋白表达和抗体筛选的有力工具 Angelika Lueking, Martin Horn, Holger Eickhoff, Konrad Bussow, Hans Lehrach, and Gerald Walter 中华基因网译 摘要：基因组序列的信息是由蛋白表达才行使其功能的，进而使生命能够正常进行。我们研究和发展了一个在cDNA微矩阵上进行基因表达谱研究的一种辅助的方法，这种技术能够在芯片大小的蛋白微矩阵上进行大量的基因表达和抗体筛选。这种技术应用一种带有一种新的转移图章的机械手进行点样，蛋白溶液被高密度的点在聚偏二乙烯二氟（PVDF）膜上。在此膜上能够高灵敏度的检测出经纯化的特殊蛋白。在该试验中，用92个人cDNA克隆在酶标板上表达所得细菌溶胞物作为蛋白质点成芯片，在此芯片上能够可靠地进行纯化的蛋白表达物的检测。假阳性克隆和以不正确阅读框架来表达蛋白的比率低。所挑选克隆产物的特异性在相同的芯片上应用单克隆得到证实。带有一些不相关蛋白的一些抗体的交叉反应表明，用来检测抗体特异性的蛋白质芯片可以对蛋白的整个库进行检测。因为这种应用不仅仅局限在抗原-抗体体系，蛋白质芯片也能够为基因表达和受体-配体相互作用的大量检测提供一个普遍的方法。 关键词:微距阵;机械人技术;蛋白质;基因;表达；抗体；筛选 尽管整个人类基因的40-80%现在已经以表达序列标签（EST）的形式在dbEST数据库（/dbEST）中存在，只有一小部分基因确定了其功能。而整个基因组表达的检测被认为是功能研究的必要前提。自动技术使应用综合表达方式的分析测定大量基因活动成为可能，从而得到致病的与正常的或发展中的不同组织的比较指纹。从高密度的过滤膜开始，DNA微矩阵现在已经被开发成芯片的形式。应用微矩阵，已经得到了Arabidopsis thaliana 、 Saccharomyces cerevisiae和人类淋巴细胞和组织如骨髓、脑、前列腺和心脏的基因表达谱。CDNA微矩阵已经被应用于检测复杂疾病如类风湿性关节炎、黑素瘤、尤因瘤等。从逻辑上讲,下一步应获得差异表达的cDNA克隆编码的蛋白产物谱。这就要求有一个高度平行方法来进行蛋白表达分析,包括大量的cDNA克隆在合适的载体系统上同时表达和蛋白产物高速点阵。 我们在前面已经指出cDNA文库能够在高密度的过滤膜上进行的检测（21）。应用机械人技术，把人类胎儿脑cDNA表达文库（hEx1）点阵在酶标板上，然后把细菌群体定格在PVDF过滤膜上，诱导融合蛋白的原位表达和应用抗体来检测一个含有His6标签的原位。我们现在已经把这种方法进一步发展，应用一个装有一个平台的点样机械手的新的印章来自动点阵细菌融合物形成蛋白芯片。这些蛋白芯片能够进行高灵敏的蛋白表达和抗体特异性筛选，而且能够为大量的受体－配体相互作用的研究提供一个强有力的工具。 材料与方法 载体构建 pQE-30NS载体在以前的文章中已有描述（其在GenBank中的序列标识号为AF074276）。载体pQE－BE6应用PCR反应在pQE-30NS载体的MRGS和His6中插入编码LNDIFEAQKIEW的寡聚核苷酸肽，这样就使RGS－His6变成两部分。 抗体 混合液中的单抗及厂家如下：Qiagen生产的鼠抗RGS-His，1:2000稀释；诊断研究公司生产的克隆6C5，鼠抗兔GAPDH，1：5000稀释；Transduction实验室生产的克隆68鼠抗HSP90，1：2000稀释，Serotec 有限公司生产的鼠抗－α微管蛋白。 二抗是F（ab）２兔抗鼠IgHRP（sigma） 和F（ab）２鼠抗兔IgHRP（Serotec Ltd.）,1:5000稀释，分别用来检测大鼠和小鼠的单克隆。 大规模蛋白表达和纯化 蛋白质在大肠杆菌SCS1株系的液体培养基中表达。用含有100μg/mlAP和15μg/ml 卡那900升SB培养基转接10ml大肠杆菌SCS1株系，37℃摇菌，过夜培养，直到OD600达到0.8，加入IPTG含量到1mM。在37℃培养3.5小时，然后在4℃冰上冷却。用在2100克离心10分钟进行细胞收集。用100ml磷酸缓冲液重悬，然后离心。细胞在溶解缓冲液中溶解，置冰上30分钟，每克湿重细胞加缓冲液3ml，缓冲液中含有0.25mg/ml溶解酵素。DNA在冰上应用50%的功率超声波均液进行打碎三次，每次1分钟。混合物用10000g离心30分钟澄清。然后加入NTA琼脂糖，在4℃下摇晃1小时混合。混合液到入一个柱子中，然后用10倍体积的含有20mM咪唑的缓冲液冲洗，之后用含有250mM咪唑的缓冲液洗涤蛋白，再用在TBS溶液过夜透析。 大量的小规模的蛋白表达 从人类胎儿脑的矩阵cDNA表达文库hEx1中挑选的克隆进行蛋白表达。这