同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定.pdfVIP

中国虐亏通搪 2010，26(2)：38—44 ChineseAgriculturalScienceBulletin 同源重组快速构建百合LCHS2基因 RNAi表达载体及其鉴定 化 占勇，刘雅莉，徐伟荣，王跃进，张雄飞 (农业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室，陕西省农业分子生物学重点实验室， 西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100) 摘 要：为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持，利 用基于同源重组原理的Gateway技术，根据课题组从东方百合 索‘邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank 登录号：GQ483376)和pENTR／D—TOPO栽体要求，设计上游5’端添加’CACC’的一对特异引物，PCR扩增 获得636bp的干扰片段 。通过TOPO克隆，将该片段克隆入载体pENTR／D—TOPO构建入 门克隆载体 pENTR／D—CHS，测序结果显示，与原序列同源性为100％。再经过LR反应使pENTR／D—CHS上的干扰片 段替换掉 目标载体pHellsgate12上的ccdB片段 ，快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体 plil2．CHSi。经 限制性 内切酶 0I、 0I酶切鉴定获得 724bp和 722bp的片段 ，与预期结果一致 。 plil2．CHSi电击法转化农杆菌GV3101，茵液PCR鉴定，出现636bp的目的条带，表明RNAi表达载体 plil2一CHSi已成功转入农杆菌。 关键词：同源重组；快速构建；c 2基因；RNAi；表达载体；酶切连接 中图分类号：$68；Q78 文献标识码 ：A 论文编号：2009．1882 RapidConstructionandIdentificationofRNAiExpressionVectorofLCHS2Genefrom Lilium BasedonthePrincipleofHomologousRecombination HuaZhanyong，LiuYali，XuWeirong，WangYuejin，ZhangXiongfei (KeyLaboratoryofNorthwestHorticulturePlantGermplasmandGeneticImprovementofMinistryofAgricuhureofChina， KeyLaboratoryforMolecularBiologyofagricultureofShaanxiPrvoince， CollegeofHorticulture，NorthwestAFUniversity,YanglingShaanxi712100) Abstract：Inordertodiscusstheeffectofdown——regulatedexpressionofCHSgeneonpigmentationofflowers andtooffertechnologicalsupportforgeneticmodificationofornamentalcharacteristicsinlilium．TheGateway technologybasedOilhomologousrecombinationwasadoptedandpertherequirementsofpENTR／D——TOPO vectorandLCHS2genesequence(GenbankaccessionNO：GQ483376)fromOrientalLilyCVSorbonne，a specialpairofprimersweredesigned，theupstream ofwhi