细胞生物 医学细胞生物学研究方法.pdfVIP

第二章.细胞生物学研究方法 • 显微成像技术 • 细胞化学技术(cytochemistry) • 细胞培养和细胞融合 • 分离技术 • 分子生物学方法 显微成像技术 • 光学和电子显微镜成像原理 三个基本要素:①照明系统，②被观察的样 品，③聚焦和成像的透镜系统 • 常用的光学显微镜 • 普通双筒显微镜(binocular microscope) • 荧光显微镜(fluorescence microscope) • 相差显微镜(phase contrast microscope) • 暗视野显微镜(dark field microscope) • 倒置显微镜 光学和电子显微镜的基本结构 分辨率(resolution) • R = 0.61 λ/n Sin α n=聚光镜和物镜之间介质的折射率. 空气为1. 油为1.5; α=样品对物镜角孔径的半角，sin α的最大值 为1; λ=照明光源的波长。 0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重 叠但仍能被区别的程度 • 数值孔径越大，进入物镜的光越多；介质的 折射率越大，则数值孔径越大，这些都可以 使分辨率提高 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 分辨本领 光源 透镜 真空 表2-2 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 300 nm 可见光 玻璃透镜 不需真空 光学显微镜 200 nm(油镜) 可见光 玻璃透镜 不需真空 100 nm 紫外光 玻璃透镜 不需真空 电子显微镜 0.1 nm 电子束 电磁透镜 真空 细胞化学技术(cytochemistry) • 酶细胞化学技术(enzyme cytochemistry) 通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞 内的定位 • 免疫细胞化学技术(immunocytochemistry) 利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分 布的一类技术。主要分为两大类: 免疫荧光 技术和免疫电镜技术。 分离技术 • 分离技术是一大类技术的总称，包括细胞 组分的分离和生物大分子的分离 • 细胞组分的分级分离 差速离心:低速 高速 密度梯度离心: 离心介质(蔗糖.甘油.氯化铯) 差速离心的原理 密度梯度离心分离溶酶体、线粒 体和微体 CsCl 密度梯度离心分离DNA 细胞培养(cell culture) • 在体外模拟体内的生理环境，培养从机体 中取出的细胞，并使之生存和生长的技术 为细胞培养技术。 • 体外细胞培养的条件 物质营养 生存环境 废物的排除 原代培养(primary culture) • 直接从机体取下细 胞、组织和器官后 立即进行培养 ■细胞系和细胞株(cell line and cell strain) ●细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系， ●细胞株: 从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离 培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞 株。 ■动物细胞培养方法 ●贴壁培养 分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分钟至几小时)就贴 附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多 态性，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。单层 培养的细胞保持接触抑制(contact inhibition)的特性。 悬浮培养