大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒扩增营养条件研究.pdfVIP

亿 爹与生 物 互程 2010，Vo1．27No．I 固 Chem istry Bioengineering 大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒扩增营养条件研究 赵雪梅 。夏 杰 ，陆 兵 。徐殿胜 (华东理工大学生物反应器工程 国家重点实验室，上海 200237) 摘 要 ：采用摇瓶实验考察 了营养条件对大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒含量 的影响。结果表明，甘油是质粒 DNA生 产的最佳碳源；C／N 比对质粒DNA含量影响明显。向改良的PDM培养基中添加 3g·L 的柠檬酸钠，可以降低糖酵 解途径 的代谢通量 ，使质粒含量达到 11．73mg ·L_。，提高 了2O 。氟化钠是糖酵解途径的抑制剂，在茵体生长8h后 ， 向改良的PDM培养基 中添加浓度为 120mg ·L 的氟化钠 ，培养后质粒 DNA含量为 12．09mg ·L-。，提高了29 。 进一步研究发现 乙醇对质粒D‘NA含量影响显著，在改 良的PDM培养基 中添加 2g·L 的乙醇，可使质粒 DNA含量达 到 12．94mg ·L～ ，提高 了32 。 关键词 ：营养 ；质粒 DNA；柠檬酸钠 ；氟化钠；乙醇 中图分类号 ：Q 789 文献标 识码：A 文章编号 ：1672～5425(2O1O)O1--0063--04 核酸疫苗 即DNA疫苗，是将编码的保护性抗原 1 实验 基因构建真核表达质粒直接导人动物体细胞内，使外 源基因通过机体内源性表达系统并提呈给免疫系统 ， 1．1 材料 诱发产生特异性免疫应答 ，以达到预防和治疗疾病 的 1．1．1 菌株与质粒 目的。由于质粒 DNA传递系统转染细胞的效率 比较 大肠杆菌DH5a菌株由复旦大学医学院提供 。质 低 ，估计提供给细胞 的每 1000个质粒分子只有 1个能 粒为在 pVAX-1的基础上构建 的质 粒 pVAXON- 到达细胞核并被表达 ，导致彻底治愈疾病需要大量 的 hCGj3，携带有 ON33寡核苷酸 ，大小为 3．7kb，具有硫 质粒 DNA，因此 ，随着核酸疫苗进入临床研究 ，必须开 酸卡那霉素抗性。 发质粒DNA的大规模生产技术。 1．1．2 培养基 质粒 DNA生产的工艺流程包括质粒 DNA 的构 LB液体培养基 ：胰蛋 白胨 10g ·L～，酵母浸 出 建、工程菌发酵、菌体收集 、细菌裂解、纯化浓缩 、质量 粉 5g ·L_。，NaC110g ·L～。 检验与包装等 ，其中重组工程菌 的发酵和质粒 DNA LB固体培养基：胰蛋 白胨 10g·L_。，酵母浸出 的纯化是影响质粒 DNA产量 的关键环节。现阶段对 粉 5g ·L一 ，NaC110g ·L-。，琼脂粉 2 (质量 比)。 发酵生产质粒 DNA 的研究方 向主要集中在培养基的 PDM 培养基 ：胰蛋 白胨 7．93g ·L_。，酵母浸 出 设计和培养条件的优化方面 ，例如，OKennedy等 ] 粉 4．41g ·L_。，葡 萄糖 10g ·L-。，Na2HPO · 研究了培养基对质粒产量的影响 ，同时就不 同发酵策 12H2O 17．096g ·L～ ，KH2PO43．00g ·L_。，NH4Cl 略对质粒产量的影响进行 了研究 。但是 ，如 以这些研 0．5g ·L～ ，MgSO 0．24g ·L_。。 究结果作为本发酵过程的操作依据，并不能解决 由不 改 良的PDM 培养基：胰蛋 白胨 7．93g·L_。，酵 同质粒、不同菌种造成的过程特殊性 问题 。为此 ，作者 母浸出粉 4．41g ·L_。，甘油 10g ·L_。，Na2HPO · 针对含有质粒 pVAXON—hCGl3的大肠杆菌 DH5a系 7