牦牛催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析.pdfVIP

’ 西 南民族大学学报 自然 学版 第36卷第 1期 J 1 Jan．2010 fo ． 1 … … … ournalofSouthwestUniversity rNationalitiesNaturalScienceEdition 文章编号：1003．2843(2010)01—0080．04 牦牛催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析 陈达文，字向东，徐华伟，黄磊，穆晓琨 (西南民族大学动物遗传育种学国家民委．教育部共建重点实验室，四川成都 610041) 摘 要：扩增出牦牛催乳素受44~(PRLR)基因部分保守序列，为研究牦牛乳腺组织中 基因表达水平奠定基础．提取 牦牛乳腺组织总RNA，根据NCB1的奶牛Jp月只基因cDNA序列的保守区设计特异性引物，采用RToPCR技术扩增牦牛 尸 尺基因，结果获得 577bp的片段，将该片段连接于pMD18-Simple质粒中，转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定阳性克隆 子，测序并分析氨基酸序列．分析序列与氨基酸与其他物种同源性，结果表明该序列与水牛、奶牛、绵羊、人、小鼠的 PRLR基因mRNA的对应序列的同源性分别为97．40％、99．13％、93．41％、71．07％、60．20％，编码的氨基酸 同源性分别 为 97．40％、100％、95．83％、82．38％、72．22％． 关键词：牦牛；催乳素受体；克隆 中图分类号：$823 文献标识码：A 催乳素(prolactin，PRL)是--~oo垂体前叶肽类激素，据报道催乳素有300多种作用，可分为繁殖和泌乳、生长和 发育、内分泌和代谢、脑和行为、免疫调节、电解质平衡六大类l【。J．这些作用由催乳素受体(prolactinreceptor, PRLR)调节．催乳素受体分布广泛，在子宫、脑、胚盘、卵巢、以及哺乳动物视网膜等组织中均能检测到l4’。j．对 小鼠的研究表明，Prlr+／．小鼠PRLR受体数量下降，导致PRL信号传导水平下降，从而使Prlr+／．小鼠泌乳受阻． PrIr-卜，．小鼠乳腺的发育及腺泡分化减弱，导致STAT5磷酸化下降，从而降低了乳蛋白基因的表达 7【J．由于催乳 素受体有重要的作用，因此对催乳素受体基因的克隆及分析很有意义．本研究的目的是通过RT-PCR扩增出牦牛 催乳素受体的保守序列，为下一步实验检测牦牛乳腺组织催乳素受体基因的表达量研究牦牛的乳腺发育规律和 分子遗传研究积累基础资料． 1 材料和方法 1．1 试验材料 从成都近郊屠宰场刚屠宰的牦牛中取小块乳腺组织，迅速置液氮中保存，运回实验室．SimplyPTotalRNA Extractionkit为BioFlux公司产品，pMD18TVector、PremixTaqDNA聚合酶、TaKaReRNAPCRKit反转录试剂 盒为宝生工程(大连)有限公司产品，其他试剂均为进口分装或国产分析纯． 1．2 总RNA提取和cDNA第一链的合成 从液氮中取出100mg左右的牦牛乳腺组织，按照SimplyPTotalRNAExtractionKit提供的方法抽提牦牛乳 腺~,RNA．根据TaKaReRNAPCRKit反转录试剂盒推荐的方法以~,RNA为模板，合成cDNA第一链． 1．3 PRLRcDNA 部分序列的RT-PCR扩增 根据奶牛PRLRmRNA序列(GenBank登录号为NMI74155)，利用oligo6进行引物设计，序列为：Forward primer：5’GAGAATCCGGAAACAAACCTTACAT3’：Reverseprimer：5’CCTTCTTGGCTG GTTCTTCTA ACAG3扩’增产物大小为577bp，由上海英俊生物有限公司合成． 收稿 日期：2009．10。21 ‘ 联系作者：字向东(1963．)，男，白族，云南云龙人，西