实验：包埋法固定SOD 及固定化酶性质测定.pptVIP

一、实验目的要求 了解酶的固定方法及其应用 掌握包埋法制备固定酶的操作方法 固定化酶的应用 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基, 超氧阴离子自由基氧化羟胺形成亚硝酸盐． 亚硝酸盐在显色剂的作用下呈现紫红色． 用可见分光光度计测其吸光度. （当被测样品中含SOD时, 则清除超氧阴离子自由基的作用,减少亚硝酸盐的形成.通过测定样品管和对照管的吸光度就可以计算出样品中的SOD活力.） 三、实验步骤 1. 22.5％聚丙烯酰胺固定化酶液配制： 取一个EP管，按下表配制固定酶液（1ml） 配制完后立即混匀 2.球状固定化酶的制备：用取样器吸取50μL(胶-酶混合液) ，分别滴加到白瓷板的20个孔中，待凝胶聚合。 3.冲洗凝胶表面未固定化的SOD酶。 用蒸馏水洗涤球状固定化酶3-5次。 4.固定化酶活性测定：采用黄嘌呤氧化法测定SOD活力(方法看SOD活力测定试剂盒说明). 5. 固定化酶热稳定性的测定 取三支试管，分别加入SOD酶液5μL ，蒸馏水5μL及10个球状固定化酶，放到75℃ 水浴保温10min。 取出迅速冷却到室温。 按上表各加入SOD反应液 。 测定OD 550nm值。 四、实验结果与分析 * * 　　实验：包埋法固定SOD 及固定化酶性质测定 二、实验原理 固定化酶(immobilized enzyme) :　 　　固定化酶又称固相酶。通过物理或化学的方法将水溶性的酶与水不溶性载体结合，或使酶固定在一定的空间范围内进行催化反应。　 固定化酶的特点： 　　可使生产工艺自动化，连续化，增强酶的抗性，提高酶的使用效率． 吸附法固定化技术（物理吸附法－活性炭） 包埋法固定化技术（琼脂糖，ＰＡＧＥ琼脂、海藻酸盐，聚酰胺、聚脲、 聚酯） 结合法固定化技术（共价，离子） 交联固定化技术（戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐） 酶的固定化方法： 可装成酶柱用于连续生产． 可以制成酶膜、酶管等多种形式的酶反应器。 要用于生产精细的特殊化学品、药品 食品工业中也将得到广泛使用 用于各种疾病的诊断、治疗及人工脏 器 用作化学分析的酶电极 固定化酶用作燃料电池 固定化酶用作亲和层析手段，分离和提纯酶的底物、辅酶、抑制剂及抗体等， 酶活性测定原理 SOD活力计算 对照OD值-样品OD值 对照OD值*50％ x稀释倍数 SOD活力＝ (U/ml) （每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位） 本实验是用一定浓度的聚丙烯酰胺作为包埋剂，将SOD包埋在多孔的网状结构的聚丙烯酰胺凝胶内而制成固定化酶。 0.1 0.1 试剂四 0.1 0.1 试剂三 0.1 0.1 试剂二 不加 加固定酶 样品 1.0 1.0 试剂一 对照管 样品管 试剂(ml) 充分混匀后,37度水浴40分钟, 加 2 2 显色剂 混匀, 室温放置10分钟, 波长550nm, 蒸馏水调零,比色 1.计算SOD固定化酶的活性 2.计算热处理后固定化酶和游离酶的活性。 3.SOD固定化酶活力损失多少。 4.比较固定化酶和游离酶对热的抗性情况。 5.对实验结果进行分析。