小鼠骨髓高增殖潜能内皮祖细胞培养与促增殖因子与研究.pdfVIP

摘 要 目的：用含小鼠骨髓内皮细胞系条件培养液(BMEC．CM)的 培养体系，进行骨髓高增殖潜能内皮祖细胞(HPP．EPC)及其后代 细胞的培养和纯化，建立这些细胞的一种扩增培养方法。检测小鼠 骨髓内皮细胞系细胞的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤 达水平，分析BMEC．CM促进EPC增殖的分子机理。 方法和结果：本实验分为以下三个部分：． 1．总EPC集落形成实验制备小鼠骨髓单细胞悬液，骨髓细胞预 贴壁培养6h后，吸出含未贴壁细胞的上悬液，移入新的培养瓶，并 添加BMEC．CM，进行二次贴壁培养。培养5d后用胰酶法将贴壁细胞 消化下来，洗涤后计数。以每删112孔底面积1个细胞(1佃哪2)的密度， 将这些细胞种入培养板，培养体系中仍添加BMECCM。观察贴壁细 胞集落的形成，计数集落数和计算集落形成率。数码显微拍摄集落， 计数集落细胞数，用集落平均细胞数绘制细胞生长曲线，并计算细胞 群体倍增时间(DT)。 按原代骨髓细胞种植后的天数计，9～12d可见EPC细胞簇，2～3 d内形成集落(细胞数≥50)，集落形成率为每106骨髓有核细胞生成 d左 纺锤形。大部分集落约在l周内生长较快，以后生长减慢，至30 h、74．4h、 131．2h、358．2h。 58．O 2．HPP．EPC集落形成实验及单集落源细胞的扩增培养和鉴定 用上述消化和洗涤的贴壁细胞，以每栅2孔底面积50个细胞(50／衄2) 的密度种入培养板，培养体系同前，每周换液。观察贴壁细胞集落的 形成，计数细胞数达5000左右的集落，计算集落形成率。进行单集落 细胞扩增培养，每4d做细胞计数，按单个集落绘制细胞生长曲线和计 算DT。用扩增细胞做CD3 验和Dil．Ac．LDL摄取实验。 按原代骨髓细胞种植后的天数计，28～35d时细胞数5000左右的 HPP．EPC集落形成，其细胞紧密聚集，细胞形态大多为椭圆形和圆形， 集落形成率为3．O士0．6个／106NBMCs。单集落源细胞传代扩增培养显 示，细胞在低密度时可形成索状和网状排列，高密度时细胞呈铺路石 状排列。在原代骨髓细胞种植后50～53d，DT最短，平均为51．2h； h。至原代骨髓细胞种植后80d左 在74～77d时间段，DT延长至324．2 免疫荧光染色阳性，能结合FITC．UEA．1和吞噬Dil．Ac．LDL。 3．mBMEC细胞中三种细胞因子mRNA水平的检测而zol法提 取小鼠骨髓内皮细胞系细胞RNA，进行荧光实时定量逆转录PCR，检 测VEGF、bFGF、IGF．1mRNA的表达水平。PCR结果显示mBMEC 细胞高水平表达VEGFmRNA和bFGFmRNA，而IGF．1mRNA的表达 水平较低。 Ⅱ 结论：添加BMEC．CM的培养体系十分适合小鼠骨髓EPC的生 长，用这种体系进行HPP．EPC单集落源细胞培养能大量获得其后代 细胞。骨髓内皮细胞系细胞高水平表达VEGF和bFGF，这可能是 BMEC．CM促进EPC增殖的重要分子基础。这些结果还为内皮细胞 与EPC之间的反馈调控机制提供了新的实验证据。 ， 关键词：内皮祖细胞，体外扩增，内皮细胞条件培养液，生长因子， 骨髓，小鼠 IⅡ ABSTRACT was tocultI鹏and ective：The p血匆 obj presentstudydesi印ed endothelial potential progenitor 11ighprolifel-atiVe and