悬浮法培养的人胰腺癌PANC+1细胞生成肿瘤干细胞球的初步与研究.pdf

悬浮法培养的人胰腺癌PANCl细胞生成肿瘤 干细胞球的初步研究 中山大学附属第二医院消化内科 学位申请人：崦淑莉 导师：张世能教授 摘 要 胰腺癌是起源于胰腺外分泌腺恶性程度很高的肿瘤。由于胰腺癌早期症状隐 匿，临床表现缺乏特异性，早期诊断十分困难。确诊时已失去根治性手术的机会， 而传统的放疗、化疗虽能使胰腺癌肿瘤体积缩小，但大部分肿瘤经过一段时间后 又出现转移和复发。近年流行病学研究显示：胰腺癌在国内外的发病率呈上升趋 势，严重威胁人类的健康和生命。 越来越多的研究资料显示，肿瘤组织和细胞系中存在着一群比例极少的肿瘤 stem 干细胞(Cancercells)，其具有自我更新、多向分化潜能和高致瘤性，对 放疗和化疗天然耐受，在启动肿瘤发生和发展中起决定性的作用，被认为是肿瘤 生成、生长、转移、复发和耐药的基础。迄今，已有研究证实在白血病、脑肿瘤 和乳腺癌等多种类型肿瘤中存在肿瘤干细胞。 肿瘤干细胞的理论为肿瘤发病机制的研究提供了崭新方向。对胰腺癌干细胞 的研究有利于进一步阐明胰腺癌的发病机制，为胰腺癌的临床诊断和治疗提供新 的思路和策略。 本研究前期从胰腺癌细胞系Swl990中成功分离具有肿瘤干细胞特征的侧群 (Side population，SP)细胞并初步分析其生物学特性，由于缺乏胰腺癌干细胞 特异且公认的表面标志物，本研究借助无血清悬浮法培养分离干细胞技术，拟从 人胰腺癌PANCl细胞中分离具“干性的胰腺癌肿瘤干细胞。无血清悬浮培养法 是利用干细胞能耐受无血清培养条件，在此培养环境中通过增殖形成干细胞球的 原理来分离和富集干细胞的方法。此法最早用于培养成体干细胞。目前已有报道 用此方法分离出脑肿瘤干细胞，乳腺肿瘤干细胞和结肠肿瘤干细胞。由此法分离 出来的肿瘤干细胞球具有自我更新、多向分化、高致瘸性、对放疗和化疗耐受等 特性。 研究目的 采用无血清悬浮培养法从胰腺癌PANCl细胞筛选出肿瘤干细胞球，进一步分 析其生物学特性，从而为靶向胰腺癌干细胞的治疗提供实验基础。 材料和方法 实验材料： 胰腺癌细胞系PANCl为中山二院消化内科保存；NOD／SCID免疫缺陷小鼠购 自中国医学科学院，6～8周龄，此项实验于本校实验动物研究中心进行。 实验方法： 1．细胞培养： PANCl：常规培养在含10％胎牛血清的RPMI—1640培养基 B27 50×、青霉素100U／m1、链霉素100ug／m1) 2．免疫荧光检测上皮标志蛋白CKl8的表达 3．Western blot检测上皮标志蛋白CKl8的表达 4．NOD／SC工D小鼠致瘤实验 5．流式细胞技术检测PANCl肿瘤干细胞球及其来源细胞系的周期分布。 6．流式细胞技术检测表面标记CDl33和CXCR4的表达。 迁移能力 8．WST一8法耐药实验检测PANCl肿瘤干细胞球及其来源细胞系对胰腺癌常用化 疗药物GEM、5一FU、ADM的耐药性。 统计学方法 数据以均数±标准差表示，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采 用单因素方差分析。应用SPSSll．0统计软件进行统计学处理。显著性差异水平 为P0．05。 结果 1．悬浮法能够培养PANCl干细胞球且PANCl干细胞球具有“干性：在无血清培 养基中悬浮培养约4’5天，开始形成球状，折光性好，中间密度高的PANCl 肿瘤干细胞球，继续培养至10天，15天，干细胞球逐渐增大，中心密度更 高； PANCl肿瘤干细胞球能够在体外连续传代并保持一定的干细胞球形成 率，PANCl肿瘤干细胞球已连续培养至第20代，PANCl细胞系的干细胞球形 成率为(5．75±1．7)‰，PANCl第l代干细胞球细胞的干细胞球形成率为 球从无血清培养转换为10％胎牛血清的1640培养基中培养诱导其分化，能够 贴壁生长，随着分化的时间延长，其形态与来源细胞系越来越相似。免疫荧 光显示诱导PANCl干细胞球分化后，分化的细胞能表达上皮标志蛋白CKl8。 Western 小鼠成瘤实验显示PANCl干细胞球具有高致瘤性，2×103数量的细胞就能使 小鼠成瘤。