不同方式保存的蜘蛛基因组DNA提取方法的探索.pdfVIP

蛛形学报Act a Ar a chnol ogi ca Si ni ca ，No v．2009 ，18 2 ：88 ．9 1 I SSN 1 00 5—9 628 doi ：10．3 969 ／j ．i s sn ．1005— 9628．2 009．0 2 ．008 不 同 方 式 保 存 的 蜘 蛛 基 因 组 DNA提 取 方 法 的 探 索 卢晓亮唐贵 明’张慧赵娜娜 内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特0 10022 摘要：基因组DNA的提取是在分子水平上进行研究的基础，提取的DNA的纯度、浓度及结构 的完整性是进行 基因工程各项研究的前提条件 。本文用SDS法、CTA 法和饱和NaCI 法等3种方法分别对75 ％乙醇浸泡、无水乙 醇浸泡 、一20 C冷冻及新鲜蜘蛛标本基 因组DNA进行提取，并进行 比较 。实验结果表明：使用SDS法提取一20 C冷 冻保藏的蜘蛛标本基因组DNA，可 以达到分子生物学研究的要求。 关键词 ：蜘蛛；保存方式；基因组DNA；DNA提取 分子生物学的飞速发展，使人们对生物体的认识已从形态结构深入到分子水平。通过分析不同物种 DNA分子 的结构异同来探讨物种 的起源与进化，已成为现代生物学 的研究热点之一。利用分子生物学 技术从核酸水平对动物进行物种鉴别以及探讨物种 的起源和进化，是现代生物系统学和生物进化学 的 研究热点之_ 二，这类研究的基础是获得物种的DNA。在使用分子生物学方法研究动物分类中的若干 问 题时，如何用简单、省时的方法从动物体内获得高质量 的DNA，是后续实验的前提。基 因组DNA提取方 法研究报道较多 田英芳等，1999 ；刘波等，1999 ；王智等，1999；印红等，2002；童丽娟等，2 002 ；安瑞生 等，2002 ，但对不 同保藏处理 的标本基因组DNA提取研究不多 靳然等，2007 。本研究分别采用SDS 法、CTA 法和饱和NaCI 法等3种方法，提取了4种保存方式下的蜘蛛基因组DNA，并对实验结果进 行了比较 ，找出3种方法及4种保存方式的优缺点，结果表明，在蜘蛛分子生物学研究中采用SDS法提 取一2 0℃冷冻保存标本 的效果最为理想。 1材料 4种保存方式的蜘蛛标本：新鲜标本、冷冻标本、75 ％乙醇浸泡标本和无水乙醇浸泡标本。 所有供试材料均为雌I 生星豹蛛，乙醇浸泡标本于采集地直接进行处理，冷冻标本将活体带回实验室 冷冻保存，为防止消化道 内食物对DNA的污染，实验时均切去腹部进行操作。 75％乙醇浸泡标本、无水 乙醇浸泡标本、冷冻标本均于2008年5月1日采 自呼和浩特市小井沟。 新鲜标本为2009年5月2 日采自呼和浩特市小井沟。 2方法 2 ．1标本的预处理 乙醇浸泡标本用蒸馏水浸泡l 昼夜，期间换水3次。冷冻标本与新鲜标本用75 ％乙醇消毒后蒸馏水 冲洗，灭菌滤纸吸干后切去腹部备用。 2 ．2基 因组DNA提取 2．2 ．1 SDS法 田英芳，1999 提取缓冲液：由A液、 液和蛋 白酶K溶液以8 ：l ：1的比例配制而成。A液：Tr i s 0 ．05 M；Na Cl 0 ．1 M； Na 2EDTA0 ．1 M。调pH值为7 ．以7 ．8，灭菌后于4℃保存 。 液：5 ％的SDS 。蛋 白酶K溶液：2 mg ／mL，一20 ℃ 保存。平衡酚 。氯仿：异戊醇 24：1 体积 比 。无水乙醇和70 ％乙醇，置于．2 0℃冰箱预冷 。TE缓冲液：1 M M Tr i s ；0 ．2 Na2EDTA调pH值为8 ．0。 将蜘蛛从浸泡液中取出，迅速用双蒸水清洗表面，用灭菌滤纸吸干，切除腹部后置于1．5 mL离心管 中，加入600肚L提取缓冲液，用灭菌钝头镊子研磨至溶液较清澈透 明为止；38 ℃温浴3 h ；在混合液 中加 入等体积 的平衡酚，上 下缓慢颠倒10次，10 000 r pm离心 10 mi n ，取上清加入等体积 的氯仿：异戊醇，上 嗵讯作 Cor r espondi ng au t h or E-ma i l ：t gm4 392 896@i mnu．e du ．cn 收稿日期 Rec ei v ed ：2 009 ．06 ．0 4 内蒙古师范大学研究生科研创新基金 c ⅪJ s 08003 项 目资助项 目 Nov ．，2009 卢晓亮等：不同方式保存的蜘蛛基因组DNA提取方法 的探索 下缓