细胞生物学研究技术.ppt

细胞生物学研究技术 一 细胞形态结构的观察方法 （一）、光镜技术 1、几种常见光学显微镜 A 普通光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；③机械装置，用于固定材料和观察方便。 ※分辨率与放大倍数 分辨率：指显微镜能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： R=0.61λ /N．A． 其中 N．A．＝ｎsinα/2 （n=介质折射率；α=镜口角；N.A.=镜口率； λ＝入射光波长） 放大倍数＝物镜倍数 目镜倍数＝N.A（500－1000） 部分介质的折射率 介质 空气 水 香柏油 α溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66 普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm。 B 暗视野显微镜 使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。 C 相差显微镜（PCM） 1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 应用：观察未经染色的标本和活细胞。 一种介壳虫的染色体（PCM照片） D 倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 E 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） F 微分干涉差显微镜（DIC显微镜） 能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。 尼康E800荧光DIC显微镜 DIC显微镜下的硅藻 G 激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜） 可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 2 光镜标本的制备 以石蜡切片为例： 材料处理 固定 脱水 包埋 切片 染色 观察 染色剂：普通染色剂，荧光染色剂 3 光镜技术的应用 A 观察活细胞的形态结构，生命运动， 细胞周期。 B 细胞器的定位及功能研究。 C 基因产物与大分子物质的定位及定量。 D 监测细胞代谢活动。 例：胞内钙离子浓度的监测 钙是通用的第三信使，能特异地选择性地调节细胞的活动，因此测定细胞中钙离子浓度在空间和时间上的变化，对于监控许多细胞的生理活动有重要作用。如受精时，卵细胞突然定位地将钙离子释放到胞浆中。 钙指示剂：FuRA－2，水母发光蛋白等 沙元双细胞胚中一个细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光 罗丹明123染色后显示的细胞线粒体的定位 （二）、电镜技术 1、透射电子显微镜（TEM） 透射电子显微镜以电子束为光源，由于电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短，因而使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可达0.2nm。 电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 2 扫描电子显微镜（SEM） 扫描电子显微镜（SEM），可用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体