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宫颈癌特异抗原MN.CA9的多糖蛋白表达载体的构建及鉴定_医学论文
宫颈癌特异抗原MN.CA9的多糖蛋白表达载体的构建及鉴定_医学论文
【关键词】 宫颈癌
摘要 :目的 克隆宫颈癌MN.CA9抗原的多糖蛋白cDNA，并构建表达载体。 方法 从宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA，RT-PCR法扩增MN.CA9抗原的多糖蛋白cDNA，将其插入载体pCA13，转化大肠杆菌JM109，构建MN.CA9抗原的多糖蛋白表达载体pCA13-MN。酶切及测序鉴定。 结果 酶切及序列分析结果证明，目的基因成功克隆入载体。 结论 成功构建了MN.CA9多糖蛋白表达载体。
关键词 :宫颈癌MN.CA9抗原多糖蛋白基因克隆
Abstract:Objective To obtain the cDNA of proteoglycan protein of MN.CA9antigen of cervical cancer and construct the eukaryotic gene targeting vector pCA13-MN.Methods The total RNA was extracted from human cervical carcinoma cell line HeLa and the intact cDNA of proteoglycan protein was amplified by RT-PCR.The cDNA was cloned into pCA13vector and transformed into E.coli JM109.Results The result of sequencingwas completely consistentwith the published sequence of the proteoglycan protein cDNA.Conclusion The proteoglycan protein cDNA of MN.CA9antigen in human cervical cancer has been successfully cloned for preparing the tumor vaccine of MN.CA9antigen.
Key words:cervical cancerMN.CA9antigenproteoglycan proteincDNA cloning
宫颈癌的发病率高居发展中国家女性恶性肿瘤的首位。放射治疗是宫颈癌主要治疗方法之一，但对于中、晚期患者疗效并不理想［1］ 。近年来，基础研究表明宫颈癌基因治疗具有应用前景，与放疗联合使用可显著提高进展期宫颈癌局部控制率，特别是对放射耐受的肿瘤［2］ 。针对肿瘤特异抗原蛋白或DNA的瘤苗，可以诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肿瘤的杀伤作用。宫颈癌抗原MN.CA9的发现，使利用瘤苗治疗宫颈癌成为可能。为此，构建MN.CA9的多糖蛋白cDNA表达质粒，以期为制备MN.CA9瘤苗治疗宫颈癌奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要材料 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、内切酶XhoⅠ、HindⅢ及T 4 DNA连接酶购自Promega公司人宫颈癌HeLa细胞、大肠杆菌JM109、质粒pCA13由徐州医学院郑骏年教授惠赠。
1.2 总RNA提取 取HeLa细胞约1×10 5 个，按试剂盒说明提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl无核酶水中，-80℃保存。
1.3 RT-PCR 根据GenBank发表的MN.CA9cD-NA序列，设计引物，由Invitrogen公司合成。上游引物:5’-ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCA-GGAG-3’，引入HindⅢ酶切位点。下游引物:5’-CCAC-CGCTCGAGTGAAGC-GGCCCGCGCAG-3’，引入XhoⅠ酶切位点。加入总RNA20μg作为模板，上、下游引物至终浓度1μmol.L，用Promega公司的RT-PCR试剂盒进行反转录及PCR扩增。反应条件为:94℃30s，60℃1min，68℃2min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
1.4 cDNA的克隆及扩增 PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和XhoⅠ双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，酚-氯仿纯化。然后与经相同酶切后回收纯化的pCA13质粒室温连接5h，将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，氨苄青平板筛选，37℃培养过夜。挑取单克隆阳性菌落，LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明提取质粒，酶切鉴定。
1.5 序列分析 由上海
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