抗大豆Ⅱ号亚型钙调素单克隆抗体的制备与鉴定_医学论文.docVIP

抗大豆Ⅱ号亚型钙调素单克隆抗体的制备与鉴定_医学论文 抗大豆Ⅱ号亚型钙调素单克隆抗体的制备与鉴定_医学论文 作者：王红 吴萌 赵宝华 赵亚朴 【关键词】 大豆,钙调素,亚型,单克隆抗体 　　[摘 要] 目的: 制备抗大豆Ⅱ号亚型钙调素(SCaM2)单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法: 从含有pSCaM2的大肠杆菌BL21中, 提取并纯化SCaM2。以其作为抗原免疫BALB/c小鼠后, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合、 筛选及克隆化, 建立稳定分泌SCaM2 mAb的杂交瘤细胞株, 并对抗SCaM2 mAb进行鉴定。结果: 经两次细胞融合, 共获得10株可稳定分泌抗SCaM2 mAb的杂交瘤细胞株。对其中3株杂交瘤细胞制备的腹水mAb（6F11F3、 7C5E9、 7E10E2）, 用间接ELISA及免疫印迹实验表明, 在高稀释度时, mAb 6F11F3可识别SCaM1和SCaM2, 而mAb 7C5E9和7E10E2可分别识别SCaM4和SCaM5。Ig亚类鉴定结果表明, mAb 6F11F3和7C5E9均为IgG2a, mAb 7E10E2为IgG1。相加实验的结果显示, mAb 6F11F3和7C5E9可能识别SCaM2相同的抗原表位 而mAb 7E10E2可能识别不同的抗原表位。mAb 6F11F3对SCaM2的亲和常数为（2.127±0.418）×106M-1, mAb 7C5E9对SCaM4的亲和常数为（9.69±2.406）×106M-1, mAb 7E10E2对SCaM5的亲和常数为（1.203±0.429）×107M-1。结论: 制备了可识别不同SCaM亚型的mAb 6F11F3、 7C5E9及7E10E2, 为研究SCaM的特性及功能提供了重要的制剂。 　　[关键词]大豆 钙调素 亚型 单克隆抗体 　　植物钙调素(CaM)有多种亚型, 它们在生化特性、 组织分布及生物学功能等方面具有各自的特性。通过对不同亚型CaM进行亚细胞定位, 可了解各个亚型CaM的意义, 并在此基础上研究不同亚型CaM在植物生长发育过程中的作用及调节机制。我们制备了抗大豆2号亚型CaM（SCaM2）的单克隆抗体(mAb)并对其特性进行了鉴定。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pSCaM2和大肠杆菌BL21（DE3）由河北师大细胞学实验室惠赠。BALB/c纯系小白鼠, 由河北医科大学实验动物中心提供。Sp2/0Ag14小鼠骨髓瘤细胞, 由河北省科学院生物所提供。牛血清白蛋白、 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG及HT、 HAT、 胎牛血清, 均购自华美生物工程公司。IPTG为InaIC公司产品。标准低分子量蛋白、 Phenylsepharose 4B疏水亲和层析柱为Pharmacia公司产品。弗氏完全佐剂、 不完全弗氏佐剂、 TMB、 DMEM培养基、 IgG亚类检测试剂盒为Sigma公司产品。其他试剂为进口分装或国产分析纯试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 SCaM2的提取与纯化 参照文献[1]的方法, 提取并纯化SCaM2。将含有pSCaM2质粒的大肠杆菌BL21进行培养, 在IPTG诱导下表达SCaM2蛋白。将表达的SCaM2通过PhenylSepharose 4B疏水亲和层析柱纯化后, 以SDSPAGE进行鉴定。 　　1.2.2 动物免疫及杂交瘤细胞株的建立 将纯化的SCaM2加完全福氏佐剂经颈背部皮下注射免疫BALB/c纯系小鼠, 20 μg/只。间隔3周, 以相同的途径注入用不完全福氏佐剂乳化的SCaM2抗原（用量同前）免疫, 共2次。选择抗体效价高的小鼠, 于细胞融合前3 d, 再以等量抗原的PBS溶液腹腔注射加强免疫1次。细胞融合、 筛选、 克隆化及腹水制备, 均按实验室常规方法进行。 　　1.2.3 mAb一般特性的鉴定 (1)Ig亚类鉴定: 采用经典的免疫双扩散法进行。中央孔分别加入20 μL辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA抗血清标准品, 周围孔依次加入各种抗SCaM的mAb腹水, 以骨髓瘤细胞的培养上清液作为对照, 置湿盒中于4℃下扩散48 h, 观察结果。(2)mAb的效价测定: mAb腹水经辛酸硫酸胺沉淀法[2]纯化后, 用间接ELISA法测定其效价。(3)特异性鉴定: ①ELISA鉴定: 以各亚型SCaM分别包被酶标板, 用间接ELISA检测腹水mAb与不同亚型SCaM的反应性, 结果以A450值表示。②Western blot分析: 将不同亚型的SCaM经SDSPAGE分离后, 电转移到0.33 μm的硝酸纤维素膜上。滴加含有30 g/L BSA的PBST封闭过夜后, 依次滴加纯化的腹水mAb及辣根过氧化物酶标记的羊