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枸杞RAPD反应体系的建立与优化_药学论文 枸杞RAPD反应体系的建立与优化_药学论文 作者：严奉坤，许兴，殷敏，杨亚亚，王娜【摘要】 目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上，根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系：20μl体系中含1× PCR buffer，50 ng模板，0.4 μM 10碱基随机引物、1UTaq DNA聚合酶、2 mM Mg2+，125μM dNTPs。 结论 枸杞的RAPD反应体系能够用于枸杞的RAPD分析。 【关键词】 枸杞； RAPD； 反应体系 　　Establishment and Optimization of RAPD Reaction System in Lycium barbarum 　　Abstract：ObjectiveTo study the RAPD reaction system in Lycium barbarum L. and optimization of it. MethodsBased on the RAPD reaction system was often used in our lab, RAPD reaction system was tested by the result of RAPD. ResultsAn RAPD reaction system suitable for Lycium barbarum L. was established, that was, 20μl amplification containing 1× PCR buffer,50ng template DNA,0.4μm primer,1UTaq DNA polymerase,2 mmol/L Mg2+, 125 μmol/L dNTPs. ConclusionThe RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in Lycium barbarum . 　　Key words： Lycium barbarum； RAPD； Reaction system 　　RAPD由Williams和Welsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项分子标记技术［1，2］，是目前中药研究者最常使用的DNA标记技术，但RAPD易受各种因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不同，因此在对枸杞进行RAPD分析时，完全有必要对各因子的反应条件进行优化，建立稳定的、最佳的反应体系。本研究力图通过实验建立一种适合枸杞的RAPD反应体系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料实验所用的材料为枸杞道地品种宁夏枸杞的主栽品种宁杞1号，采自宁夏农业生物技术重点实验室试验地。 　　1.2 仪器与试剂PCR仪（PTC-200TM Peltier Thermal Cycler，M J Research，Inc，USA）；电泳仪（DYY-10C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp-31型；北京六一仪器厂）；SmartSpecTM 3000核酸蛋白测定仪（BIO-RAD Lab，Inc，USA）；Eppendorf 5415D离心机；UVP GDS-8000凝胶成像系统。 　　Buffer、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、300bp DNA ladder购自北京天为时代公司， 10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose（Promega公司），EB（瑞士Fluka Chemika公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 枸杞基因组DNA提取枸杞基因组DNA提取根据严奉坤等［3］的提取法进行。 　　1.3.2 PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。初始扩增条件采用本实验室长期使用的20 μl反应体系，其成分为：10×Buffer（不含Mg2+）加0.8 μl 25 mmol/L Mg2+，1 μl 2.5 mmol/L dNTPs，1 UTaq DNA聚合酶，1 μl 0.375 μmol/L 10碱基随机引物，50 ng模板。反应程序：预变性94℃ 2 min；预扩增程序：94℃ 20 s，36℃ 30 s，72℃ 1 min，5个循环；扩增程序：94℃ 20 s，40℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。扩增产物经含有0.5 μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（72v电压下电泳45 min），电泳结束后在UVP GDS-8000凝胶成像系统上观察照相。 　　2 结果 　　RAPD标记对PCR反应条件有较高的要求，因此