用PCR┐SSCP及DNA测序法研究胃癌p53基因突变_医学论文.docVIP

用PCR┐SSCP及DNA测序法研究胃癌p53基因突变_医学论文 用PCR┐SSCP及DNA测序法研究胃癌p53基因突变_医学论文 【关键词】 基因 　　关键词: 基因，p53突变胃肿瘤聚合酶链式反应银染色法序列分析，DNA 　　摘 要:目的 探讨p53基因突变与人类胃癌发生的关系. 方法 运用PCR、PCR-SSCP结合银染法对25例胃癌组织p53基因第4、第5～6和第7外显子进行突变检测运用双脱氧链终止法对第7外显子阳性突变标本进行DNA测序. 结果 在25例胃癌组织中检出突变5例，突变率为20%在第7外显子阳性突变标本中发现了18bp的大片段缺失. 结论 p53基因突变与人类胃癌的发生具有明显相关性，并且这种突变可能不仅仅局限于点突变，大片段缺失也是p53基因突变方式之一. 　　Keywords:genes，p53mutationstomach neoplasmspoly-merase chain reactionsilver stainingsequence analysis，DNA 　　Abstract:AIM To investigate the relationship between the mutation of p53gene and human gastric cancer.METHODS Mutations in exon4～7of p53gene were examined in25cases of gastric cancer by PCR and PCR-SSCP-Silver stain-ing.In addition，Sanger method（dideoxy-mediated chain-termination method）of DNA sequencing was used to examine the exon7which was positive in p53mutation.RESULTS Mutations were found in5cases（20%），and a large frag-ment deletion of18bp was also found in exon7which was positive in p53mutation.CONCLUSION There is a strong correlation between p53mutation and human gastric cancer.Moreover，the mutation may not be confined to point muta-tion only.It can be a large fragment deletion. 　　0 引言 　　p53基因是一个广谱的抑癌基因［1，2］ ，大约50%的人类肿瘤与p53基因的突变、过量表达或杂合性丢失有关［3-9］ .该基因全长16～20kb，包括11个外显子，第4到第8外显子是其突变的热点区域［7，10-12］ .p53蛋白是一种Mr =53的磷酸核蛋白，野生型的p53基因对调节细胞分裂、诱导细胞的程序化死亡、抑制肿瘤细胞的生长有着重要的作用.突变后的p53基因则能促进细胞分裂和转化，从而导致肿瘤的发生.可见，它在肿瘤发生中起着一种负调控作用.胃癌是黄色人种中高发肿瘤之一，我国胃癌发病率达5～40/10万，因此对胃癌的病因学探讨和研究，对于该肿瘤的预防和治疗，有着重要的理论意义和实践价值.我们应用PCR，PCR-SSCP（PCR-Single strand conformation polymorphism）结合银染法和DNA序列分析技术，对南京地区25例胃癌患者手术切除标本进行了p53基因突变研究，首次发现在中国人胃癌中存在p53基因的大片段缺失，为胃癌的病因学提供了又一分子生物学依据. 　　1 材料和方法 　　1.1 标本采集和DNA制备 胃癌组织及癌旁正常组织标本共25对，均取自手术切除标本，由南京铁道医学院附属医院提供，并经病理科鉴定.手术切除后的标本立即置-80℃保存备用.所有标本采用常规酚氯仿法提取基因组DNA. 　　1.2 引物序列及PCR扩增 　　1.2.1 PCR引物的选择与合成 选择p53基因突变热点第4，第5～6和第7外显子进行PCR及PCR-SSCP，其引物由上海细胞生物学研究所合成，引物序列见Tab1. 　　表1 PCR扩增所用的3对引物　略 　　1.2.2 PCR扩增体系 10×PCR reaction buffer5μL5×dNTPs2μL1对引物各1μL模板DNA1.0μgTaq酶1U加H2 O至50μL，加盖石蜡油. 　　1.2.3 PCR反应循