研究生实验 细胞融合.pptVIP

* * 实 验 原 理 1. 细胞融合，即在自然条件下或利用人工方法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双或多核细胞（异核体细胞）的过程。随后，异核体细胞进行有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。 2. 细胞融合的方法： 细胞融合的基本概念 二、人工诱导下： 1、病毒诱导融合（仙台病毒） 2、电融合 3、激光融合 4、化学融合（PEG） 一、自然条件下：精卵融合 Skeletal muscle 利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。 PEG促融合机制 实 验 原 理 PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。 PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。 PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至5~10分钟。 融合时的温度: 由于生物膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞, 一般采用的温度为37~40℃。 影响PEG融合效果的几种因素： 实 验 原 理 本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为: 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别； 2. 实验材料廉价、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。 关于实验材料 实 验 原 理 实验步骤 1、取10%鸡红细胞悬液1 ml移入离心管中，加Hanks液至5 ml ，混匀； 2、1000 rpm离心2 min，倾去上清液，加入5 ml Hanks液再次悬浮细胞，混匀，再次离心2min，弃上清； 3、在管中加入0.5ml的Hanks液，用吸管充分混匀，制成细胞悬液，放在37℃水浴箱中预热。用血球计数板对细胞悬液计数。 4、吸取37℃预热的50% PEG 0.5 ml，在37℃水浴箱中，于90秒内逐滴沿壁滴加到装有预热细胞悬液的离心管中，边加边轻轻摇动离心管，使之与细胞混匀， 37℃静置5min； （※此全部过程都要求在37℃水浴内进行※） 5、向离心管中加入Hanks液9ml，轻轻吹打混匀，在37℃水浴箱中静置10 min以终止PEG的作用。（该步骤吹打过程应彻底，以稀释PEG及排除假融合） 6、1000 rpm离心2 min，弃去上清液，加入0.5 ml Hanks液，充分混匀。取细胞悬液一滴制成临时装片，盖上盖玻片观察细胞融合情况。（需要计算细胞核时可加入适量0.2%亚甲基蓝染色） 结 果 观 察 总细胞核数 融合细胞核数 先从形态上识别未融合细胞，找到融合后的双核细胞或多核细胞,并注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞 ? 计算细胞融合率： 融合率=　　　　　　×100% 细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。 细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视 野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示