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第３章 蛋白质的通性、纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性：两性 ，PI 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）蛋白质是胶体溶液：原因（运动、水化层、同电）、性质（布、丁、不） （二）蛋白质沉淀：方法 1、盐析 2、有机溶剂 3、重金属盐 4、加热 5 生物碱试剂和某些酸 三、蛋白质分离纯化的一般原则 1、前处理 2、粗级分离 3 细分级分离 四、蛋白质的分离纯化方法 （一）透析和超滤 透析：利用无机盐等小分子可以 透过半透膜，蛋白质大分子不能 透过半透膜的性质来纯化蛋白质的方法。 （二）凝胶过滤 洗脱过程 （三）、盐溶和盐析 （四）、凝胶电泳和等点聚焦点 蛋白质电泳常用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 （五）、亲和层析分离 利用独特的化学性质，分离效力大 （六）离子交换层析 （七）有机溶剂分级分离 （八）高效液相层析/高效气相层析 * * 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析（分子排阻层析，分子筛层析）：基于蛋白质分子在大小和形状的差异建立起来的方法。 基质：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）或聚丙烯酰胺。 盐溶：在盐浓度很稀的范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度升高。 盐析：随着溶液中的盐浓度升高，蛋白质的溶解度逐渐降低，蛋白质分子相互聚集发生沉淀。 (NH4)2SO4分级沉淀：不同蛋白质在不同盐浓度中溶解度有差别。 第四节 蛋白质的分离与鉴定 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native) 被分离的物质保持天然的结构，具有生物活性 迁移率取决于荷质比（q/r） 样品不处理，直接点样 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS) SDS：十二烷基硫酸钠 第四节 蛋白质的分离与鉴定 双向电泳 等电聚焦电泳 SDS特点：分辨率高 电泳后的蛋白质检测 考马斯亮蓝染色：一种染料，结合在蛋白质的碱性基团上，检测灵敏度为0.2~0.5μg 银染：银离子被还原，成黑色,灵敏度比考马斯高１００倍 第四节 蛋白质的分离与鉴定 配体：能与某种蛋白质专一结合的分子 如： 酶与辅酶、酶与专一性抑制剂、抗体与抗原、激素与受体等 常用的阳离子交换剂 常用的阴离子交换剂 适合分离等电点大于7的蛋白质 适合分离等电点小于7的蛋白质
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