分子生物学技术原理与应用.pptVIP

RNAi 的作用机制 转录沉默(Transcriptional gene silencing ,TGS) 抑制：使组蛋白和DNA 发生甲基化作用 转录后沉默(post transcriptional gene silencing ,PTGS)机制 翻译抑制：ssRNA 可与mRNA 的3’- 非翻译区(3’- UTR)特异性地结合,从而抑制mRNA 的翻译和相应的功能蛋白质合成。 Cap AAAAAA Cap AAAAAA Cap AAAAAA 循环 复制酶 Dicer 切割 （三）RNAi 的生物学功能 病毒防御 抑制转座子的转座，保护基因组的完整性 调节基因表达。 在翻译水平调节机体发育。 清除畸变的RNA 。 （四） RNAi 技术的应用 基因功能研究：利用RNAi技术使目的基因沉默，研究基因的功能。 如利用RNAi技术证明ag-1基因与拟南芥花的发育有关。 Chiou-Fen Chuang and Elliot M. Meyerowitz* PNAS April 25, 2000 vol. 97 No. 9 4985–4990 （四） RNAi 技术的应用 2.临床应用：RNAi 机制可作为真核生物的基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因的表达。 3.在药物研究中的应用 （1）辅助药物靶点的确证 （2）RNAi 药物研究  第六节 基因芯片（Gene chip） Gene chip or DNA chip: are a combinatorial array of oligonucleotides synthesized on a solid support (modified glass or polypropylene) in situ at specific “addresses” in a checkerboard like arrangement. 样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子。与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。 Measurements: images, quantitation, specifications 基因芯片具有巨大的应用前景 基因功能分析研究 检测与疾病相关的基因, 进而用于疾病诊断 药物筛选 检测基因突变 第七节：生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study 一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 常用蛋白质相互作用的研究技术 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。 （一）标签蛋白沉淀 标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。 （二）染色质免疫沉淀法 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 第八节：遗传修饰动物模型的建立及应用 The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal