第三章细胞生物学的研究方法.ppt

本章内容提要 第一节显微镜技术 第二节细胞的分离与培养 第三节细胞组分的分离和纯化技术 第四节[自学] 第五节[自学] 第六节[自学] 学习目的和要求 掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用； 熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点； 了解细胞生物学研究方法的进展。 第一节 显微镜技术 一、光学显微镜技术 【光镜下所见物体结构称为显微结构】 普通光学显微镜 构造： 光学系统 机械系统 照明系统 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 光镜样本的制备 固定(fixation)：使大分子交联而留在原位 ，防止其他处理使结构移位或信息丢失。常用的固定液：甲醛、戊二醛。 包埋(embedding)：组织硬化便于切片，防止样品移位。常用包埋剂：液体石蜡、树脂。 切片(section)：样品过厚则无法观察，需切成1～10μm的薄片。 染色(staining)：增大反差。 封固 荧光显微镜 Fluorescence microscope 原理：利用较短波长的光（如紫外线）使样品受到激发产生较长波长的荧光，用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置。 应用： 定性定位定量的研究组织内的荧光标记物质 对活细胞中分子的动态变化进行实时观察 荧光显微镜与普通显微镜的构造区别 照明方式通常为落射式 光源为短波光(一般是紫外光) 两组特殊的滤光片 No1：置于光源与标本之间，仅能通过荧光染料的激发光； No2：置于目镜与物镜之间，仅能通过激发出的荧光。 相差显微镜 Phase contrast microscope 应用：观察未经染色的标本和活细胞 原理：利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。 结构特点：物镜后装有一块“相差板”(phase plate)或称相位板(annular phaseplate)，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差，结构比周围介质更加变暗。 暗视野显微镜 Dark field microscope 原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。 特点：适于观察物体的轮廓和运动，但分辨不清内部的微细构造。 应用：适合于观察活细胞的结构、细胞内微粒的运动以及液体介质中的细菌和真菌等。 显微电影摄影技术 原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄记录一次，然后以正常速度放映，所拍摄的情节被大大加快。 应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度 共聚焦激光扫描显微镜 Laser confocal scanning microscope, LCSM 原理： 单色激光作为光源 共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像。 逐点扫描 特点：通过改变焦平面，获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。 应用：广泛应用于亚细胞结构与组分等方面的研究。 二、电子显微镜技术 【用于观察亚显微结构或超微结构】 透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 原理：以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长比光波短得多(10万伏特电压加速的电子，波长约0.004nm)，且电子束波长与加速电压(通常50～120KV)的平方根成反比，即电压越高波长越短，故用电子波代替光波可提高显微镜的分辨率。 高压透射电镜（High-voltage Electron Microscope，HVEM） 加速电压一般在20万伏特以上，加速电压越高，电子波长越短，电镜的分辨率也越高。 加速电压＞50万伏特称为超高压电子显微镜。 电子的穿透能力更强，可观察更厚的电镜切片。 在10万伏特下，可以见到3-7μm厚切片中的细胞超微结构。加速电压在300万伏特时，可以观察到10μm厚切片中的细胞超微结构。 主要电镜制样技术 超薄切片的制备 金属投影法 冰冻断裂技术 冷冻蚀刻技术 超薄切片厚度一般仅为40～50nm 固定：保持样品的超微结构尽可能接近活体状态。双重固定：锇酸→脂类，戊二醛→蛋白。 脱水：以便置于高真空中进行观察。常用系列梯度的乙醇或丙酮进行。 包埋：使样品有一定的刚性和韧性，耐受干燥以及电子轰击、高温和真空挥发。常用的包埋剂有环