《生物化学实验》教.docVIP

《生物化学实验》教案 实验一　 糖的还原性及多糖的实验 一．实验目的 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法；了解鉴定还原糖的方法及其原理。熟悉淀粉多糖的碘实验反应原理和方法，了解淀粉的水解过程。 二．实验原理 费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu2+ 的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O ①。此法常用作还原糖的定性或定量测定。其反应表示如下： 目前临床上多用本尼迪特法，因此法具有：①试剂稳定，不需临用时配制；②不因氯仿的存在而被干扰；③肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小等优点。 淀粉广布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。本试验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶或难溶于水的性质来制备淀粉。 淀粉遇碘呈蓝色①，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖大多能与碘呈特异的颜色，此类呈色物质也不稳定。 淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖，最后水解成葡萄糖，其过程如下： （C6H10O5）x (C6H10O5) y C12H22O11 C6H12O6 淀粉 各种糊精 麦芽糖 葡萄糖 淀粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。 　 实验二 　蛋白质的两性反应和等电点的测定 一、实验目的 了解蛋白质的两性解离性质，学会一种测定蛋白质等电点的方法。 二、实验原理 蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基、巯基、胍基、咪唑基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调解溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（pI）。当溶液的pH值低于蛋白质等电点时，即在Ｈ+ 较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的pH值大于等电点时，即在ＯＨ- 较多的条件下，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子。 阳离子 兼性离子 阴离子 pHpI pH＝pI pHpI 在电场中： 向阴极移动 不移动 向阳极移动 蛋白质等电点多接近于pH=7.0，略偏酸性的等电点也很多，如白明胶的等电点为pH=4.7，也有偏碱性的，如精蛋白等电点为pH在10.5～12.0。在等电点时 蛋白质溶解度最小，容易沉淀出。 实验三 　蛋白质含量的测定——紫外线吸收法；蛋白质的沉淀反应 一、 实验目的 学习紫外线（UV）吸收法测定蛋白质含量的原理，了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。学习了解蛋白质沉淀反应的原理及方法 二、实验原理 由于蛋白质中存在共扼双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280毫微米处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度值（O.D.280，或吸收值）与其浓度呈正比关系，可作定量测定。 该法迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用。本法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液内有时混杂有核酸，应与校正。核酸强烈吸收波长为280毫微米的紫外光，它对260毫微米紫外光的吸收更强。但是，蛋白质恰恰相反，280毫微米的紫外吸收值大于260毫微米的紫外吸收值。利用它们的这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果还存在一定的误差。 蛋白质盐析作用 原理：向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即析出。这种作用称为盐析。 操作： 取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵（此时硫酸铵的浓度为50%）微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵。） 将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否沉淀。 注意： 应先加蛋白溶液，然后加饱和硫酸铵溶液