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实训二 MS培养基的配制与灭菌（3学时） 一、目的要求 通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。 二、仪器与用具 1、仪器：酸度计或pH试纸、电磁搅拌器、电炉 2、用具：高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标签 3、试剂：配制MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1 N 、0.5N NaOH，0.1 N 、0.5N HCl 三、方法步骤 （一）MS固体培养基的配制 1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。 2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。 注意：配500ml培养基用1000ml烧杯。 3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。 如配制1000ml培养基： 需：MS大量元素母液 100ml MS微量元素母液 10ml MS铁盐母液 10ml MS有机物母液 10ml 4、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。 5、加入蔗糖（30g/L），溶解。 6、定容：用容量瓶。 7、调pH值：一般pH=5.8。 用0.1 N 和0.5N 的NaOH和HCl 将pH调至所需的数值。 注意：①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2—0.8，故调整后的pH值应高于目标pH值0.5个单位。 ②pH值的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。 ③如果pH值与所需的数值相差很大，可先用0.5N的NaOH或HCl调节，至接近时，再用0.1N的酸、碱调节。以免加入过量的水溶液，导致溶液体积增大，培养基不能很好地凝固（因加入的琼脂量一定）。 8、分装到大三角瓶中（500ml、1000ml）。 9、加琼脂（6-10g/L）。常用6.6--7 g/L 10、封口：用棉塞或锡箔纸、牛皮纸。注明培养基名称、配制时间。 或者：5、加入蔗糖。 6、加琼脂，煮沸1-2分钟（熔化琼脂）。 7、定容，pH值。 8、分注到培养瓶中。100-150ml培养瓶每瓶装入20-35ml左右的培养基。 （二） MS固体培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） 1、洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。 2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。 3、装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！） 4、装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。 5、灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。 注意：①先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！） ②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。 ③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。 四、作业 1、将本次实训内容写成实训报告。 2、高压灭菌时应注意哪些问题？ 3、配制培养基时应注意哪些问题？ [编辑本段] MS培养基的配制步骤 　　这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。 　　大量元素(母液Ⅰ) mg／L 　　NH4NO3 33 000 　　KNO3 38 000 　　CaCl2·2H2O 8 800 　　MgSO4·7H2O 7 400 　　KH2PO4 3 400 　　微量元素(母液Ⅱ) 　　KI 166 　　H3BO3 1 240 　　MnSO4·4H2O 4 460 　　ZnSO4·7H2O 1 720 　　Na2MoO4·2H2O 50 　　CuSO4·5H2O 5 　　CoCl2·6H2O 5 　　铁盐(母液Ⅲ) 　　FeSO4·7H2O 5 560 　　Na2-EDTA·2H2O 7 460 　　有机成分(母液Ⅳ)ⅣA 　　肌醇 20 000 　　ⅣB烟酸 100 　　盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 　　盐酸硫胺素