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蛋白质分离纯化与层析技术进展 鲍时翔?? 姚汝华 ( 华南理工大学生物工程系) 摘?? 要?? ?? 蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。文中分析了蛋白质分离纯化 的特点, 指出了分离纯化蛋白质应解决的一些问题。层析技术是一种有效的蛋白质纯化方法, 文 中从层析方法、层析固定相、层析过程的数学模拟三方面评述了层析技术的新进展。 关键词?? 蛋白质; 纯化; 层析; 分离 中图资料分类号?? TQ 201??21; O658??1 近20 年来, 生物技术的发展非常迅速。运用基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技 术, 已能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。 和其它生物产品的生产过程一样, 蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中 游过程是运用生物技术生产目标产物, 下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、 纯化、加工目标产物。目前, 生产蛋白质的上、中游技术如基因突变、基因重组与表达、基因工 程菌的大规模培养等技术发展很快, 而下游蛋白质分离纯化技术却没有得到相应发展。很多 蛋白质在实验室规模已生产成功, 但却无法走向工业化生产而取得经济效益和社会效益[ 1] 。 因此, 急需发展蛋白质分离纯化技术。 1 ?? 蛋白质分离纯化的特点和需要解决的问题 1??1 ?? 蛋白质分离纯化的特点 1) 大多数蛋白质产品是生物活性物质, 在分离纯化过程中, 有机溶剂、溶液pH 值、离子强 度的变化均可使蛋白质变性失活。 2) 蛋白质产品在物料中含量很低, 且物料组成非常复杂。例如, 利用基因工程菌发酵生 产蛋白质, 物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等, 目标蛋白质的含量常常不 到蛋白质总量的1%。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体, 为获取蛋白质, 还 需进行细胞破碎, 结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。 3) 含蛋白质产品的物料不稳定, 蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。 4) 很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用, 因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的, 产品无菌、无致热源等。 1??2 ?? 实现蛋白质产品的分离纯化应解决的问题 1) 设计蛋白质产品分离纯化的最佳工艺, 用最少的分离步骤获得最大的产率, 同时确保 来稿日期: 1996??01??18 鲍时翔, 男, 1966 年生, 博士后; 主要研究方向: 蛋白质纯化工程, 发酵工程。华南理工大学生物工程系, 邮 编: 510641 蛋白质产品的纯度。 2) 发展蛋白质纯度的快速分析检测技术。在下游的各道工序, 准确、快速地对蛋白质产 品进行纯度分析和活性检测, 以保证产品的质量。 3) 搞好上、中、下游技术的配合, 便于蛋白质产品的分离纯化。大多数蛋白质产品的分离 纯化, 需消耗大量的人力、物力, 因此应尽可能改进上、中游技术, 减少下游过程负荷。例如, 利 用金黄色葡萄球菌, 发酵生产A 蛋白。通常, A 蛋白结合于菌体胞壁上, 需要进行细胞破碎, 然后将A 蛋白从胞壁上剪切下来, 过程繁琐, 难度大。若运用生物技术培养出A 蛋白分泌型 菌来生产,A 蛋白的分离纯化就容易得多。 2 ?? 层析技术在蛋白质分离纯化中的地位 ?? ?? 分离纯化蛋白质的方法很多[ 2] , 对于不同的目标产物, 分离纯化方法不同。选择合适的 工艺路线, 取决于目标产物的理化、生物特性。例如, 目标产物和杂质的密度不一样, 可采用离 心技术加以分离; 目标产物和杂质在一定的溶液环境中溶解度不同, 可采用沉淀技术加以分 离; 目标产物和杂质在亲水性高分子两相溶液中分配不同, 可采用双水相萃取技术加以分离; 若目标产物和杂质等电点不同, 可采用离子交换层析和电泳技术分离。通常, 为获得高纯度目 标产物, 往往需要综合利用目标产物的理化特性, 采用多种分离技术组合, 但分离步骤多, 分离 时间长, 则影响目标产物的得率和回收。 在众多的蛋白质分离纯化技术中, 层析是一门关键的技术, 它通常在分离工序的后部, 决 定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比, 层析技术具有以下特点: 1) 分离效率高。离 心、沉淀、双水相萃取技术往往只能获取粗产品, 而运用层析技术, 可得到纯度较高的生物产 品。例如, 在中空纤维膜反应器内培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体, 单克隆抗体存在于杂交瘤 细胞培养液中。采用沉淀分离技术只能获得粗产品, 为提高单克隆抗体纯度, 还必须结合离子 交换层析、分子筛层析等[ 3]。若运用亲和层析技术, 以A 蛋白为配基, 从杂交瘤细胞培养上清 液中, 经一步纯化, 得到的单克隆抗体纯度可达到电泳纯[ 4] ; 2) 和电泳分离相比, 层析过程易 于放大, 易于自动化。若采用电泳技术分离蛋白质, 虽然产品纯度非常高, 但其过程却产