蛋白质分离纯化的方法.docVIP

分离纯化蛋白质的四种关键性方法 分离蛋白质的方法有许多种，应根据原材料和生产条件来选择具体的分离纯化方法。例如：李凤英等用盐溶法提取葡萄籽的蛋白质。李喜红等用酶法从脱脂米糠中提取蛋白质。郭荣荣等碱法与酶法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究得出结论是碱法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性优于酶法提取的大米蛋白，而酶法提取的大米蛋白的溶解性、乳化稳定性和泡沫稳定性优于碱法提取的大米蛋白。王桃云等就是运用这种方法配合使用加热法提取葎草叶蛋白陈申如等用酸法提取了鲢鱼鱼肉蛋白质，提取的蛋白质无腥味，色泽洁白，蛋白质产率高，可达左右。 1区带离心法 区带离心法是分离蛋白质的有效而且常用的方法。该法的第一步是在离心管中形成一个密度梯度(常用蔗糖梯度)，然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。超速离心时，即通过密度梯度移动，并根据其沉降系数而被分开，最后各种蛋自质在离心内被分离成各户独立的区带，可以在管底刺一小孔逐滴放出，分部收集。 根据欲分离蛋白质混合物的相对分子质量的上限和下限选择合适的凝胶凝胶过滤由于上样量受到柱床体积限制，常用在纯化路线的最后一步，此时的样品蛋白溶液杂质量很低了，经过凝胶过滤就可纯化。当然，根据样品蛋白溶液的特征，也有把凝胶过滤放在提纯最初步骤中的。 在基因工程药物蛋白质的生产中,必须要采取一些合理的措施保护目的蛋白质的活性及稳定性,如在缓冲液中添加还原剂(如二硫苏糖醇)阻止巯基基团被氧化,添加蛋白酶抑制剂防止蛋白质的降解,添加金属鳌合剂(如EDTA)除去重金属离子等,维持蛋白质的结构并保持其活性。固定金属离子亲和色谱 自从1975年Porath等提出固定金属离子亲和色谱(IMAC)概念以来,这项技术在蛋白质的分离纯化中得到广泛应用。该法是基于蛋白质对固定在基质上金属离子亲和能力的不同进行分离,较其它亲和色谱法有许多优点:不固定金属的裸柱可作为阳离子交换剂来分离一些带正电荷的蛋白质,除去水中微量金属,对水进行净化和消毒;固定金属离子的色谱柱,在低离子强度下可作为金属螯合柱分离亲和金属的蛋白质,在高离子强度下金属螯合柱又显示疏水特性,可作为疏水柱分离不同疏水性的蛋白质;利用同一基质可制成吸附性能不同的金属螯合柱,固定金属离子的再生和更换非常容易,柱寿命长;在多数情况下蛋白质通过柱子仍保持生物活性;与其它亲和柱相比,蛋白质负载量高,容易放大和工业化。 由于IMAC具有上述特点,一直受到生物色谱学家的青睐,他们在理论和应用方面都作了大量工作,其中最大的改进是应用组氨酸标记来分离重组多肽或蛋白质。