蛋白质的分离纯化与分析鉴定(改).docVIP

蛋白质的分离纯化 摘要：蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点。蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往采取几种方法联合使用。在目标蛋白情况下,应根据各种法的基本原理和应用情况,设计纯化程序关键词：蛋白质，分离纯化，蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。生物体内的大部分生命活动如催化代谢反应、物质运转、运动的相互协调、兴奋的传导、生长与发育等，均是在蛋白质的参与下完成的。因此,研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大意义,而蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节。必须要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定出合理的分离纯化方法。由于不同的蛋白质结构和性质不同,分离方法也不同例如根据分子大小可使用差速离心、分子筛、超滤或透析等分离技术；根据溶解度大小的不同，使用盐析、溶剂抽提、分配层析、结晶等方法分离；根据所带电荷的不同，可采用电泳、等电点沉淀、离子交换层析等方法；根据结合亲和性，可用新和层析进行分离。蛋白质的分离纯化技术种类是很多的而且发展很快某些技术如以前不多见的超滤分离方法,目前在国内应用已相当普遍，除此之外广泛使用的层析、电泳方面也不断出现新的技术和方法。如层析方面,高压液相色谱是一种具有快速和分辨力的柱层析技术。 蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离，提纯和鉴定是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往采取几种方法联合使用。如将等电聚焦电泳与SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳结合起来则可达到极高分辨率的分离效果。 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。电泳的类型很多，常用的是聚丙烯酞胺凝胶电泳SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳和等电聚焦电泳。在聚丙烯酞胺凝胶中加SDS的电泳称为SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳。SDS能破坏蛋白质中几乎所有的非共价键，使蛋白质变性并且SDS和蛋白质结合成净负电荷很多的SDS—蛋白质复合物，复合物的电荷量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，同时也改变了蛋白质分子原有构象，使SDS一蛋白质复合物在电泳中的迁移率主要取决于分子量的大小而其他因素的影响可以减少到忽略不计的程度。SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳具有快速、灵敏、分辨率高、重复性好的优点。主要用于蛋白质的分离鉴定和分子量测定。 等电聚焦电泳是根据蛋白质等电点的不同来分离蛋白质的电泳方法。这种电泳的特点是：在支持物凝胶中加人两性电解质，建立一个由正极到负极,pH由低到高的连续而稳定的pH梯度环境。蛋白质混合物在这种凝胶上电泳时,具有不同等电点的蛋白质就会分别带上正电荷或负电荷,向着与它们各自的等电点相当的pH环境位置,最后聚焦在此位置形成一条集中的蛋白质区带。这样,经过一段时间后,不同的蛋白质组分便被分隔在不同区域之中,各蛋白质聚焦部位的pH值即为它们的等电点。等电聚焦电泳具有分离、制备和鉴定蛋白质等多种功能，它的优点很多,如分辨率高,可将pH值之差小到0.01的蛋白质分开；能抵销扩散作用,使区带越走越窄；无论样品加在什么部位都可以聚焦到等电点；可以直接测出蛋白质的等电点,等等。 电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。 、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 4、离子交换层析：生物大分子和离子交换剂之间的相互作用主要是静电作用导致介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子发生交换以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。传统的离子交换树脂不适用于分离蛋白质等大分子物质,主要原因是它们的交联度较大,因而空隙小不能允许大分子的进人,而且电荷密度较高,结合比较牢固,使吸附的蛋白质等生物大分子易变性。由于离子交换剂的交换容