人骨髓基质细胞移入兔去核卵母细胞的异种克隆研究.pdfVIP

第二届中国现代医学研究方法暨学科交叉创新研讨会论文汇编 因此，原发性肝癌的辨证分型与基质降解密切相关，肝郁脾虚型主要为删P2升高，湿热蕴结型、气 栓有关，但与肝功能无关。明确不同辨证分型与基质降解的关系，充分发挥中医药优势，有机得把中医 药合其它治疗措施结合起来，提高临床疗效。但是肝癌发病机制还不是十分清楚，运用中医药独特的辨 证体系和丰富多样的治疗手段，进一步探索，促进中医药现代化的步伐。 人骨髓基质细胞移人兔去核卵母细胞的异种克隆研 南方医科大学珠江医院神经医学研究所(510282) 尚江华，邹雨汐，姜晓丹，陈镇洲，秦玲莎，徐如祥 异种克隆技术已经获得了印度野牛、欧洲盘羊、爪哇野牛和非洲野猫等多个物种的后代，为珍稀动 物育种、野生濒危动物保护和灭绝物种重现等提供了新的手段，也为阐述细胞的去分化、核质互作等基 础理论提供了重要的研究材料和方法。另外，异种克隆为以非人类的卵母细胞用作核受体的治疗性克隆 研究提供了充足的卵母细胞来源。 兔作为一种重要的实验动物，在SCNT中起到非常重要的作用。目前，以兔卵母细胞为受体，通过 异种克隆已经获得了具有人遗传信息的胚胎干细胞，也获得大熊猫一兔、猫一兔、猕猴一兔、野山羊一 兔及食蟹猴一兔等的异种克隆囊胚。异种克隆为利用低价值的动物卵母细胞生产高价值的动物胚胎提供 nuclear 了理论和技术支持，使其成为体细胞核移植(somaticcell 有重要的意义和美好的应用前景。 不同种类的供体细胞，其克隆效率存在较大的差距，但以治疗性克隆为目的时还应该考虑到供体细 胞的来源和临床应用的安全性。骨髓基质细胞(BMSCs)作为成体体细胞，具有跨胚层多向分化潜能，可 直接从自体骨髓获得，并且细胞分化程度低、增殖能力强、可在体外培养大量扩增，来源充足，移植后 无免疫排斥反应。因此BMSCs在组织工程、细胞移植及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。BMSC$ 用作供体核的体细胞克隆目前已经在兔、牛和猪等方面开展了研究并获得了囊胚，甚至已经获得了克隆 动物。 本实验选用人骨髓基质细胞(hBMSC$)和去核兔卵母细胞重组构建异种治疗性克隆胚，比较不同融 合电压强度、不同注核方式对构建重构胚的影响，同时通过与兔卵丘细胞(rCCs)和兔骨麓基质细胞 胞团分离培养全能性的人类胚胎干细胞的研究提供实验基础。 材料与方法 一、主要试剂和实验动物 本研究采用的TCM．199(含25raM 激素(HCG)分别购自中国科学院动物所和宁波激素制品有限公司，其余试剂均为Sigma公司产品。细胞 和胚胎培养的塑料器皿购自美国Coming或丹麦Nunc公司。 实验动物是由广东医学实验动物中心提供的体重2．5Kg以上、健康的成年新西兰大白兔雌兔(实验 动物合格证号：0009879和0010712)。 二、实验动物的超排和卵母细胞的回收 127 第二届中国现代医学研究方法暨学科交叉创新研讨会论文汇编 则为0．05rag／只。在最后一次注射FSH 管，冲出的卵丘细胞团在0．2％的透明质酸酶中消化5．10rain，用内径略大于卵母细胞直径的毛细玻璃管轻 选取具有第一极体(1PB)的卵母细胞用含7．5 Hoechst 33342和7．5CB的mM．199中染色处理10rain。 加有10I．tg／ml pg／ml 三、供体细胞的准备 传代。传代时先吸去培养液，加入lmi 轻轻晃动培养板，使胰酶溶液均匀分布于细胞表面，倒置显微镜下观察细胞的变化；待大部分细胞回缩成 X 液，用10％FBS的DMEM重新悬浮，制成单细胞悬液，按密度(1~5 105／m1)将细胞悬液接种入新的培养瓶 中，置于C02培养箱中继续培养。经短期培养(6代以内)的卵丘细胞用作SCNT的供体细胞。使用前，卵丘 细胞先用无钙镁的PBS洗涤2次，以去除漂浮的死细胞，然后经0．25％的胰酶消化成单个细胞后离心，再用 后，股骨腔抽吸骨髓3．5ml，梯度密度