用ISSR分子标记鉴别黑木耳生产菌株的研究.pdfVIP

首届全国食用菌中青年专家学术交流会 用ISSR分子标记鉴别黑木耳生产菌株的研究 马庆芳，张介驰，张丕奇，戴肖东。孔祥辉，韩增华，壬玉文 (黑龙江省科学院应用微生物研究所，黑龙江省哈尔滨市，150010’ 个引物能对供试的z7个黑木耳菌株基因组DNA进行扩增，获得的指纹图谱清晰稳定、多态性强。用NTSYS软件进行聚类分 析，相似水平在0．75时，可将27个供试黑术耳菌株分为3个组群。研究结果说明ISSR分子标记，可以有效地用于黑术耳 生产菌株快速准确的鉴别，是黑术耳指纹图谱分析的理想手段。 关键词：ISSR：黑木耳生产菌株；分子鉴别；聚类分析 ISSR(inter simplesequence 点是：ISSR标记利用在物种基因组中经常出现的重复序列本身设计引物，无须预先克隆和测序，降低了开 发费用，并且引物可以在不同物种间通用”““；它以16～18核苷酸的重复序列为引物(3端有1～2个 选择性简并碱基)直接在基因组DNA中进行PCR扩增。1，扩增谱带稳定丰富。我所曾运用多种分子标记 鉴别黑木耳生产菌株，结果表明ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度可与RFLP 相媲美，并具有SSR的稳定性，是鉴别鉴定黑木耳菌株的非常理想的分子标记之一。 1材料与方法 1．1供试菌株 表1供试黑木耳生产菌株及来源 1．2菌丝培养及DNA提取 DNA。获得的菌丝体总DNA 0Dm一比值在1．30～1．65之间。 1．3ISSR反应 所用引物由上海生工(Sagon)合成。 1．4电泳检测 u 将ISSR反应产物与31溴酚蓝指示荆混合，用2．O％琼脂糖凝胶，0．5XTBE缓冲体系，5V／cⅢ电压电 泳，0．5ng／mlEB染色15min，以DL2000为Marker，凝胶成像扫描记录结果。 1．5数据统计分析 首届全国食用菌中青年专家学术交流会 根据PcR产物的电泳结果，在凝胶的某个相同的迁移率位置上有条带的记为l，无条带的记为0。用NTSYS 软件进行聚类分析，建立树状图谱。 2结果与分析 2．1ISSR方法鉴别黑木耳菌株指纹图谱 进行扩增，或扩增条带少，10个引物可对供试的27个黑木耳生产菌株进行扩增，从中选择了扩增重复性好、 带型清晰的4个引物作为本次试验的供试引物。这4个供试引物能对现有的27个黑术耳菌株基因组DNR 进行扩增，获得的指纹图谱多态性强，具有明显的菌株特异性。阴性对照无条带出现。 进行黑木耳DNA多态性分析，每次扩增片段多，多态性高(见图1～图3)，可用于黑木耳菌株间的亲缘关 系分析研究。 图1 ISSR引钫B扩增图谱 图2 ISSR引物c扩增图谱 圈3 ISSR引物F扩增图谱 首届全国食用菌中青年专家学术交流会 2．2ISSR方法鉴别黑木耳菌株聚类分析 关系较近或者是同一菌株。在相似水平为O．75时可将供试的27个黑木耳生产菌株分为三个组群。第一组 D28共17个菌株；第二组群包括：D2、D20、D26、D29、D30、D3l、D32共7个菌株；第三组群：D9、 D13、D24共3个菌株。 圈5ISsR方法鉴别罴术耳菌株grsY$树状图谱 3讨论 本研究运用ISSR分子标记技术鉴别黑术耳生产菌株，筛选出的引物扩增多态性强，结果稳定。在相似 聚类分析结果与传统的表观分类和同工酶分类结果基本相同，第一组群为耳根小单片簇生、耳片厚、中晚 熟品种，这一组群中的黑木耳菌株栽培面积大，占东北地区黑木耳栽培总量的90％以上，菌株名称多，菌 株间差异不大，遗传基础较接近。第二组群为菊花大朵、耳片薄、早熟品种；第三组群为耳根大单片簇生、 耳片薄、中早熟品种，在东宁县和吉林省有部分菇农栽培，第二组群和第三组群占黑木耳栽培总量的份额 很小，说明ISSR方法用于黑木耳生产菌株的鉴别是可靠的。 I)Nh指纹技术的出现，给种质鉴定带来了革命性的变化，由于它直接反映DNA水平上的差异，具有高度 的专一性和特异性，不同物种