实时荧光定量PCR技术的应用.pdfVIP

黼黼黼幽糊黼豳黼㈥ ㈣ 一掰黼 。。。．，。。，。，。_一．。．。，——。．。。，。。．，。。。。目_I■《 实时荧光定量PCR技术的应用 韩惠瑛，石丽瑞2张艳红， (1，山西省动物疫病预防控制中心030027；2，山西省阳泉市农业委员会045000) 1985年MuUis【l’4等发明了聚合酶链反应(PCR)技 2．1．1在细菌病诊断中的应用 术，成为20世纪生物医学领域革命性创举，使人们梦寐以 求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。1992年， 胞，用炭疽特异性引物进行FQ—PCR检测，可快速检测空 Higllchi最早提出了实时PCR的设想。 气中传播的芽孢。还可以用于检测伯氏疏螺旋体和支原体。 直到1995年，美国PE公司研制成功具有革命性意义的 Debeaumont闱等建立了用于检测人血清样本中布鲁氏菌 的Real—time 荧光定量PCR技术。1996年美国AppliedBiosystems公司推 出了成熟的实时荧光定量PCR(Real—timenuorescentquanti— Real—time PCR方法用于检测野猪体内的布鲁氏菌．并与细菌 tative chain polymerasereaction，FQ—PCR)技术，使高效的分离和血清学方法进行比较，结果显示该方法从血清阴性的 DNA定量、定性分析，以及高灵敏性DNA扩增成为可能。 1荧光定量PCR的特点 Real—time PCR技术建立了鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方 (1)荧光探针的使用相当于在PCR的过程中自动完成了 法，对24份结核痰样、11份布鲁氏菌基因粗提物及30份模 Southem印迹杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。 拟奶样进行检测，符合率为100％。 (2)光谱技术与计算机技术的联合应用提高了灵敏度． 2007年吴增辉【1等设计位于whA基因序列保守区的 有效的减少了劳动量。荧光定量PCR使用氩激光来激发荧光 的产生，利用荧光探测仪检测荧光信号，通过计算机进行数 100bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR。 据分析，灵敏度达到了极限，可以检测到单拷贝的基因．这 大肠杆菌、空肠弯曲杆菌是人类主要的食源性病原之 是传统的PCR难以做到的。 一，又由于其特殊的生长条件，因此常规细菌培养鉴定结果 (3)能够精确定量，对DNA扩增过程进行监测。由于 不一定可靠。国内阳成波等冈先后建立一种基于Taqman探 PCR扩增效率的差异和平台效应，传统PCR无法进行精确的 针的荧光定量PCR和SYBR greenI能与双链DNA结合而发 定量，而荧光定量PCR，由于利用扩增进入指数增长期的Ct出荧光的特性来定量检测空肠弯曲杆菌，可在60min内完 值来定量起始模板的数量，实现了精确的核酸定量检测。 (4)有效地避免了污染，传统的PCR在扩增结束后需要 用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同 电泳或紫外光下观测结果，