I群禽腺病毒12个血清型毒株Hexon蛋白全基因序列测定和酶切位点分析.pdfVIP

腺病毒 全基因序列测定和酶切位点分析 李海英1．尹燕博’。徐守振1．王建琳1．王晓红1．王守春1 (青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109) 摘要：(目的)I群禽腺病毒的不同血清型对禽类的致病性各有不同，快速准确区分I 群禽腺病毒的同血清型对临床诊断和治疗有十分重要的意义。为了对I群禽腺病毒12个血 清型进行分型，本试验对12个血清型毒株进行了Hexon全基因序列测定和聚合酶链式反应 一限制性片段长度多态性(PCR—RFI．P)分析。(方法)利用三对引物(A、B、C)分别进行I 分析，通过DNAStar软件和MEGA软件进行序列分析并绘制遗传发育进化树。(结果)研究 表明，Hexon基因全长为2800左右个核苷酸，编码约940个氨基酸，不同血清型之间的同源性 在75．2％一99．5％，变异范围是0．5．34．6％。推导的氨基酸同源性在20．7％．98．8％，差异性在 1．1％．213．O％。12个血清型之间Hexon全基因序列信息用来评价I群禽腺病毒家族的种系 发育关系，构建的进化树显示出五个主要的分支。选用限制性内切酶H∞II，利用片段D 特异性可以有效区分大部分血清型。(结论)获得了I群禽腺病毒12个血清型不同毒株的 Hexon全基因序列并进行了分子进化分析，同时结合12个血清型P(R．RFIP分析，为进一 步分析鉴别I群禽腺病毒不同血清型提供依据。 关键词：I群禽腺病毒；Hexon全基因；序列分析；PCR-RFI．P 禽腺病毒(Fowladenovims，ⅣⅣ)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分 为3个群，其中从鸡分离的I群禽腺病毒有12个血清型(ⅣⅣ1．12)。Ⅱ群禽腺病毒包括火 鸡出血性肠炎病毒(HEV)、大理石脾病毒和鸡大脾病毒，它们与I群禽腺病毒无抗原相关性。 SyIldromVirus，EDSV)，他 m群禽腺病毒目前只有一个成员，即减蛋综合征病毒(EggDrop 们只是部分的含有I群禽腺病毒的共同抗原。I群禽腺病毒含有相同的群抗原，其中比较著 名的病毒株有鸡胚致死孤儿病毒(cELoⅥms)、鹤鹑支气管炎病毒、鸡包涵体肝炎病毒【l，2】。 禽腺病毒编码的主要结构蛋白有六邻体(Hexon)、五邻体(基体、HIa)、纤突、pvI，pVⅡ， PvⅢ。已证实六邻体蛋白带有主要的属和弧属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决 定簇，可以引发极强的中和反应，当六邻体被替代或突变将导致中和免疫缺失【3】。因此， Hexon蛋白对诊断I群禽腺病毒的感染有着重要意义。 I群禽腺病毒的不同血清型对禽类的致病性务有不同【4】，快速准确区分I群禽腺病毒 的不同血清型对临床诊断有十分重要的意义。本实验以GeIlBank上的I群禽腺病毒的代表 株CELO病毒的六邻体(Hexon)基因序列为标准，设计并合成了3对引物，对12个血清型 Hexon蛋白的PCR扩增产物进行全基因序列测定，并通过软件分析，比较不同血清型毒株 所呈现的序列差异性，同时结合PCR—RFIP技术，以期从分子水平为I群禽腺病毒不同血 清型的区分提供依据。 1材料 1．1毒株、菌株和载体 AAV21 感受态细胞DH5 18-T载体，购自宝生物工程(大连)有限公司产品。SPF鸡种蛋 Q和pMD 由山东省农业科学院无特定病原鸡实验种鸡场提供。 1．2主要仪器和试剂 MG96G)，DYY31CA型水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器 PCR扩增仪(L0ngGene u DNAGelExtraction 厂)，微量加样器10，50，200，1000 l(印pendo吒Finnpipene)；AxyPreplM p L)、dNTPs(25M)为宝生物工 尉t，琼脂糖(美国P幻mega公司)，1’aqDNA聚合酶(5U／Il 程(大连)有限公司产品，氯仿、异丙醇等其它化学试剂均为国产分析纯级。 1．3引物设计与合成 5．0设计Hexon全基因