基因工程发展的分析报告.docVIP

基因工程基本条件的分析报告 摘要：基因工程操作离不开各种工具酶。这些酶可分为三大类：限制性核酸内切酶，DNA修饰酶和DNA连接酶。基因工程操作中需要在体外将不同来源DNA加以切割和拼接，有时还需要对这些DNA分子加以修饰。这些过程是通过不同的酶来完成的。 关键词：限制性核酸内切酶，DNA修饰酶，DNA连接酶 正文：一、限制性核酸内切酶： 凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶来自原核生物，有三种类型。Ⅰ型兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。Ⅱ型大多能特异识别4～6个核苷酸序列(回文结构)，最大识别序列为8个核苷酸，但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA甲基化作用，与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶。它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。Ⅲ型功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。限制酶酶切反应的因素如下：DNA的纯度限制酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所使用的DNA本身的纯度。提取DNA时，蛋白质、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐等都有可能抑制限制酶的活性。小量制备的DNA尤其会遇到这种问题。RNA一般不影响酶的反应速度，但它能和蛋白质发生非特异性结合，从而减少酶的有效浓度。识别序列的甲基化程度限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈影响酶的活性。酶切反应的温度不同的限制酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数限制酶的最适温度在37℃DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对限制酶的活性也有很大影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高可达20倍。还有一些限制酶切割不同部位的酶切位点，其效率有明显的差别。酶解缓冲液各组分的影响使用不适宜的酶解缓冲液，常是导致酶解效果不好的原因。缓冲液要新鲜配制，各种离子及其浓度要准确，pH要调准。在反应条件不恰当时，某些限制酶会出现“星号”活性，即它们不再严格遵循从识别序列酶解DNA，而会在其他的序列切断DNA酶活性限制酶的单位：在限定条件下，1小时消化1μg DNA所需的酶量为1单位。这是最为重要的。比活较低的酶，因加入的酶溶液体积大，常有甘油浓度太高的问题，为了避免甘油浓度高于5%，反应体系体积较大，对下步的电泳操作带来不便。此外，某些酶由于保存时间长，活性降低(以至失活)，或者反复取用受到污染或暴露于室温时间太久，也会导致酶活性降低。因此在进行重要样品酶解前最好测定酶活性的强弱，以免损失样品。核酸外切酶 有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶称为脱氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶称为核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶从3′端开始逐个水解核苷酸，称为3′→5′外切酶，核酸外切酶从5′端开始逐个水解核苷酸，称为5′→3′外切酶。 核酸内切酶 核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷酸基团留在3′位置上，称为5′-内切酶；而有些仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的碱基有专一要求聚合作用:在引RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。 3→5外切酶活性校对作用:这种酶活性的主要功能是从3→5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3→5外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3