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CA-MA 基因的克隆及其突变体的构建1 冯惟萍，韩跃武 兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所，兰州（730000 ） E-mail: fengwp05@163.com 摘 要：目的 构建 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体，用反向 PCR 定点突变法构建其突 变体。方法 构建 CA-MA 杂合肽重组克隆载体，采用 PCR 体外定点突变技术,设计一对 方向相反的引物,其中一个引物引入突变点，应用高保真的 Polybest DNA 多聚酶进行重组 克隆质粒 pUC-18–CA-MA 的 PCR 扩增,使 CA-MA 杂合肽第 16 位密码子由 AGT 变 为 TGG ,将扩增片段自身连接，构建 CA-MA 杂合肽突变重组克隆质粒。结果 DNA 测序 结果表明在预期位点发生突变。 结论 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体及其突变体成功构 建。 关键词：CA-MA；杂合肽；聚合酶链反应；定点突变 中图分类号：Q786 0. 引言 天蚕素 A (1～8) - 蛙皮素(1～12) 杂合基因抗菌肽为天然抗菌肽 Cecropin A 第 1～8 位氨基酸与蛙皮素第 1～12 位氨基酸融合的抗菌肽片段,它既保持了天蚕素 A 的广谱抗菌 活性，而且获得了蛙皮素的抗微生物活性[1] 。CA-MA 杂合肽与其亲代肽比较,抗微生物活性 明显提高，而其毒性显著降低[1] 。国外有学者以 CA-MA 杂合肽作为模版肽设计了几种类 似物，发现在抗菌、抗病毒方面，其类似物的活性均明显高于 CA-MA 杂合肽[2] 。目前的 研究均是用人工合成肽的方法来改造抗菌肽的结构以达到增强抗微生物的作用,但人工合成 的方法成本过高。本文通过 PCR 体外定点突变技术，寻找合适的突变位点，成功构建突变 体。 1. 材料与方法 1.1 材料 1. 1. 1 目的基因、质粒与菌株 CA-MA杂合肽基因片段由上海生物工程公司合成。克隆载体pUC-18 、工程菌 E.coli DH5α均由本室保存。 1. 1. 2 主要生化试剂 限制性内切酶及其配套缓冲液、TaKaRa MutantBEST Kit 、质粒抽提试剂盒以及胶 回收试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司。DNA Marker 购自上海生工生物工程公司。 1.2 方法 1.2.1 目的基因片段的复性、酶切及回收纯化：参照文献[3] 进行。 1.2.2. 克隆载体pUC-18双酶切、去磷酸化及琼脂糖凝胶电泳胶回收：参照文献[3] 进行。 1.2.3克隆重组体的构建： （1）、 CA-MA杂合肽基因与克隆载体pUC-18 的连接：参照文献[4] 进行。 1 本课题得到国家“863”计划项目(2006AA10A208-1-4 ) 资助。 - 1 - （2 ）、感受态大肠杆菌DH5α细胞的制备、连接产物的转化及 Amp 和 α互补筛选：参照文 献[3] 进行。 1.2.4 克隆重组体的鉴定：阳性重组体送上海生工测序鉴定。 1.2.5 定点突变 （1）、PCR 引物设计 按照突变引物设计原理,根据 CA-MA 杂合肽基因序列设计一对方向 相反的引物 Primer 1 和 Primer 2 , ,并利用 Primer Premier 5 引物设计软件对引物进行分析,