DNA环介导的恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中的应用.pdfVIP

维普资讯 生《命的化学)2006年26卷5期 462 CHEMISTRYOFLIFE2006，26(5) OTechniquesandMethods 文章编号：1000-1336(2006)05-0462-04 DNA环介导的恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中的应用 王 丽 石 磊 李 琳 (华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640) 摘要：DNA环介导的恒温扩增(LAMP)反应，是分子生物学领域中的一个新概念，它可以在恒温 (60-65℃)条 件下，3O～60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到 1o9水平。该方法的一大特色是，可以通过反应副产物—— 白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在。因此 ，对于病原微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏 感性等特点。LAMP方法在食品安全检测 、流行性病毒检测、临床诊断 ，以及水产养殖等领域的应用及研究已 有文献报道。表明，该方法已具有成功应用的现实性，为快速基因检测提供了一种新的技术途径；比PCR方法 更具推广性，可望作为常规检测工具。 关键词 ：DNA环介导的恒温扩增法 (LAMP)； 病原微生物 中图分类号：Q78 近30年来 ，全球流行病趋势表明，致病微生 补的双链 ，从而挤掉FIP引起的DNA单链 。与 物越来越 以微小多变甚至是分子的形式穿越人类 此 同时 ，BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结 空间，难培养和不能培养的病原微生物已经成为 合 ，形成的环状结构被打开，接着 ，B3引物在 传染性和感染性疾病的主要根源 ”【。一些常规的 BIP外测进行碱基配对 ，在聚合酶的作用下形成 病原菌检测方法 (例如 ，大量增殖菌数、菌落纯 新的互补链 。被置换的单链 DNA两端均存在互 化分离、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清 补序列 ，从而发生 自我碱基配对，形成类似哑铃 学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之 状的DNA结构 。LAMP反应 以此 DNA结构为起 处 ，已经愈来愈跟不上人类对致病微生物快速、 始结构 ，进行再循环和延伸 ，靶 DNA序列大量 简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物 交替重复产生 ，形成的扩增产物是有许多环的花 学水平上来研究这些病原菌的核酸结构和分子特 椰菜形状的茎一环结构 的DNA，数量级可达 10 征，将对那些难 以人工培养和不能人工培养的病 (原理见图 1【】)。 原微生物进行正确地鉴定非常适用 ，以大大提高 1．LAMP方法的特点 对病原菌的检测和研究能力。目前 ，在病原菌的 1．1扩增反应 的进行和扩增产物方便 、快捷 鉴别 分子生物学检测方法中，核酸扩增法是最有效的 LAMP反应的副产物是 白色焦磷酸镁沉淀[41， 工具之一。 肉眼即可观察 ，是鉴定反应是否进行的最直接的 2000年，Notomi等2[1开发出一种新的DNA环 参照。另外 ，LAMP扩增产物可以像 PCR反应一 介导的恒温扩增法 (1oop—mediatedisothermalamp— 样利用凝胶 电泳并结合成像系统进行检测。成像 lifieationofDNA，LAMP)。利用Bst大片段 DNA 结果显示，LAMP反应会产生许多不同大小的条 聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引 带 ，条带大小相差 100bp左右，可 以通过产生的 物 (FIP由F1C和 F2组成 ；BIP由BIC和 B2组 不同梯型来区分特异性扩增和非特异性扩增 。反 成)、外引物 (F3和B3)，特异地识别靶序列上的 应产物还可 以用限制性酶进行消化来鉴定产物的 6个独立区域。FIP引物的F2序列与靶DNA上互