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RNAi 的研究进展 RNA 干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机 制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞 后, 能特异性地降解该 mRNA , 从而产生相应的功能表型缺失, 这一过程属于转录后基因沉默机制 ( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌, 无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。 一．RNAi 的发现 早在 1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性 基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脉孢菌属(Neurospora) 中发现了相似现象,只不过将这种现象命名为基因表达 的阻抑作用(quelling) . 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans 的研 究。1995 年康乃尔大学的研究人员Guo 和Kemphues 尝试用反义RNA 去阻断par －1 基因的表达以探讨 该基因的功能,结果反义RNA 的确能够阻断par21 基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA 作为对照, 也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到3 年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello 首次将双链dsRNA ——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链 RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链 RNA 不单可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为RNA 干扰。 过去认为, 哺乳动物细胞中不存在RNAi 现象,因为较长的dsRNA 在哺乳动物细胞中能诱导IFN(干 扰素) 生成,并激活STAT 途径参与的PKR(dsRNA 依赖性激酶) 的转录,同时dsRNA 本身与PKR 结合也 能令其激活,继而磷酸化翻译起始因子 eIF2a 使之失活,导致非特异性的蛋白质合成障碍;另一方面,dsRNA 又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2 ′,5 ′腺苷合成酶,生成 2 ′,5 ′腺苷酸,激活非特异性的RNA 酶 L ,发生非特异性的RNA 降解效应。现在发现, 只要dsRNA 短于30bp ,就不会促发干扰素效应, 同时又能 特异性地降解mRNA ,引起基因沉默,说明dsRNA 在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用,为以后的基因治疗 等RNAi 应用领域提供了新的研究方向。 二．RNAi的作用机制 近年来研究发现,干扰性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类长约 21～25 个核苷酸( nt ) 的特殊双链 RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条 单链末端为5 ′端磷酸和3 ′端羟基. 此外,每条单链的3 ′端均有2～3 个突出的非配对的碱基RNAi 的主 要过程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干扰性小RNA ( siRNA) , 由siRNA 介导识别并靶向切割同 源性靶mRNA 分子. 细胞中dsRNA 的形成是RNAi 的第一步. 细胞中dsRNA 可通过多种途径形成,如基 因组中DNA 反向重复序列的转录产物; 同时转录反义和正义RNA ;病毒 RNA 复制中